Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

Summary

Her er det demonstrert hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan brukes til å oppdage og visualisere direkte protein-protein-interaksjonene mellom ATM og p53 i suspensjoncellekulturer utsatt for genotoksisk stress.

Abstract

DNA skade respons respekterer reparasjon av DNA lesjoner som oppstår spontant, er forårsaket av genotoksisk stress, eller vises i sammenheng med programmerte DNA pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- og Rad3-relatert kinase (ATR) og den katalytiske underenheten av DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PKcs) er blant de første som aktiveres ved induksjon av DNA-skade og er Sentrale regulatorer av et nettverk som styrer DNA-reparasjon, apoptose og celleoverlevelse. Som en del av en tumor-undertrykkende vei aktiverer ATM og ATR p53 gjennom fosforylering, og regulerer dermed transkriptjonsaktiviteten til p53. DNA-skade resulterer også i dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) som representerer komplekser av DNA-skadesensor og reparasjonsproteiner som akkumuleres ved DNA-skader, som er visualisert ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering av proteiner i IRIF betyr imidlertid ikke nødvendigvis dEkstreme protein-protein-interaksjoner, da oppløsningen av fluorescensmikroskopi er begrenset.

In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknikk som muliggjør direkte visualisering av protein-protein-interaksjoner i celler og vev med uovertruffen spesifisitet og følsomhet. Denne teknikken er basert på den romlige nærheten til spesifikke antistoffer som binder til proteiner av interesse. Når de forhørte proteinene er innenfor ~ 40 nm, utløses en amplifikasjonsreaksjon av oligonukleotider som er konjugert til antistoffene, og amplifikasjonsproduktet visualiseres ved fluorescensmerking, hvilket gir et signal som tilsvarer den intercellulære plasseringen av de samvirkende proteiner. Ved å bruke den etablerte funksjonelle samspillet mellom ATM og p53 som et eksempel, er det demonstrert her hvor PLA kan brukes i suspensjonscellekulturer for å studere de direkte vekselvirkninger mellom proteiner som er integrerte deler av DNA-skaderesponsen.

Introduction

DNA-skader utløser en svært regulert serie hendelser som involverer protein-protein-interaksjoner og post-translasjonelle modifikasjoner som sikrer effektiv og rask reparasjon av DNA, og derved opprettholder genomisk integritet ¹ . Typisk blir DNA-reparasjon studert i celler utsatt for ioniserende stråling ved å overvåke dannelsen av såkalt ioniserende strålingsinducert foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparasjon og DNA-skade-sensing-proteiner danner IRIF, som representerer proteinkomplekser som nukleerer ved kromatinsteder som opprettholder DNA-skade ^{2 , 3} . Plasseringen og oppløsningen av IRIFs over tid gir viktig innsikt i spatiotemporal organisering av DNA-reparasjon, og kan indikere involvering av forskjellige DNA-reparasjonsveier. Naturen til DNA-skaden og cellesyklus-scenen hvor skadene oppnås bestemmer hvilken DNA-reparasjonsvei som aktiveres. fo For eksempel, i celler som er aktivt engasjert i DNA-replikasjon (S-fase), er homolog rekombination (HR) den dominerende DNA-reparasjonsveien, mens i celler i G1- eller G2 / M-fasen av cellesyklusen, Homologe end-joining (NHEJ) reparasjonsveien dominerer. En av de tidligste hendelsene som følge av DNA-skade er aktiveringen av DNA-skade-sensing kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsakelig er aktiv i G1- og G2 / M-faser av cellesyklusen og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relatert protein (ATR), som virker i S-fase ved å aktivere HR. Både ATM og ATR er svært pleiotropiske kinaser som fosforylerer mange proteiner som er involvert i DNA-reparasjon, celledød og overlevelse ⁴ . Begge kinaser har vist seg å fosforylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 etter eksponeringen for genotoksisk stress, noe som indikerer at disse kinaser er oppstrøms mediatorer av en svingende svulstundertrykkende akse"Xref"> 5 ^{, 6} .

Dannelsen og sammensetningen av IRIFs blir typisk vurdert ved å bestemme co-lokalisering av forskjellige proteiner ved bruk av tofarget immunfluorescensfarging og mikroskopi, men ikke alle proteiner som inngår i reparasjonsproteinkomplekser danner IRIF, som begrenser anvendeligheten av denne tilnærmingen. Videre er (konfokal) immunfluorescensmikroskopi begrenset av diffraksjonsegenskapene til lys, noe som resulterer i en ganske dårlig romlig oppløsning på ca. 200-300 nm, som overskrider størrelsen på de fleste subcellulære strukturer, som i det vesentlige forbyr direkte forhør av protein-protein-interaksjoner ved Molekylært nivå. Som sådan er co-lokalisering av immunfluorescensfargemønstre som detekteres av (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indikativ for direkte protein-protein-interaksjoner. Nylig ble det utviklet nye superoppløsnings teknologier, for eksempel tredimensjonale strucTured illuminasjonsmikroskopi (3D-SIM) ⁷ , som ble vellykket brukt til å studere 53BP1- og BRCA1-IRIF-dannelse ved nanoskala detaljer, avslørende de romlige fordelingsegenskapene til disse proteinene som ikke kunne detekteres ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi ⁸ .

Flere andre metoder kan brukes til å oppdage protein-protein-interaksjoner in vivo , slik som co-immunutfelling, nedtrekksmetoder og gjær-to-hybrid screening tilnærminger. Imidlertid er disse teknikkene ganske besværlige, krever store mengder celler eller proteiner eller involverer overekspresjon av proteiner, som introduserer eksperimentelle artefakter. Mer nylig er det utviklet en ny teknikk som muliggjør visualisering og kvantifisering av protein-protein-interaksjoner in situ ( dvs. i celler og i vev), som kalles Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} . PrImary-antistoffer som gjenkjenner to proteiner av interesse, oppdages av sekundære antistoffer som er konjugert til oligonukleotider (såkalte PLA-prober). Hvis de to forskjellige sekundære antistoffene er tilstrekkelig tette på grunn av interaksjoner mellom proteiner som er anerkjent av de primære antistoffene, hybridiserer de konjugerte oligonukleotider og kan ligeres for å danne et lukket, sirkulært DNA-substrat. Dette sirkulære substratet amplifiseres deretter ved hjelp av rullesirkelforsterkning og visualiseres med fluorokrom-konjugerte komplementære oligonukleotider. Ved bruk av PLA, blir den subcellulære lokalisering av protein-protein-interaksjonen bevaret da det fluorescensmerkede merkesirkulasjonsforsterkningsprodukt forblir festet til PLA-prober. Oppløsningen av denne analysen er <50 nm, basert på funnet at diameteren av et antistoff er ca. 7-10 nm ¹¹ . Ringsirkulasjonsforsterkning kan bare skje dersom to par antistoffer (primær + sekonDary) fysisk samhandle innenfor perimeter som er definert av deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforsterkningstrinnet øker sensitiviteten til PLA-analysen og muliggjør gjenkjenning av vekselvirkninger av knapt uttrykte proteiner. PLA genererer punkterte, foci-lignende signaler som kan kvantifiseres per per-cellebasis, hvorved intra- og intercellulær variasjon i protein-protein-interaksjoner kan vurderes.

Dannelsen og sammensetningen av DNA-reparasjonskomplekser og IRIF-er blir for det meste studert i adherente cellelinjer, slik som epitelcellelinjen U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinjen RPE-1, som er hurtig- Voksende og lett å transfektere. Suspensjoncellekulturer slike lymfoide og myeloidcellelinjer benyttes sjeldnere, da disse er mindre mottagelige for transfeksjon og generelt ikke holder seg til dekselglass, og krever dermed tillegg / alternativ stEps for bildebehandling. Oppløsningen av DNA-skade er imidlertid svært relevant i sammenheng med lymfoide og myeloid maligniteter, da DNA-skaderesponsen ofte blir påvirket av genomiske (driver) avvik i disse svulstene, og spiller en sentral rolle i den ondartede transformasjonen av normal lymfoid og myeloid ( Progenitor) celler ^{12 , 13 , 14} .

Denne protokollen beskriver hvordan PLA kan brukes til å vurdere og kvantifisere protein-protein-interaksjoner etter induksjon av DNA-skade i suspensjonscellekulturer. Her blir PLA utført for å bestemme og visualisere interaksjonene mellom ATM og p53 ved DNA-skade i humane B-celle leukemiceller som er indusert til å gjennomgå en G1-fase celle-syklusarrest. Av notatet er protokollen som presenteres her ikke begrenset til å studere ATM- og p53-interaksjoner i G1-arresterte leukemiceller, men kan også brukes til å visualisere andre protein-protein-interaksjonerI forskjellige celletyper og suspensjoncellekulturer.

Protocol

1. Behandling av celler og DNA-skadeinduksjon Kultur de humane BCR-ABL + B-cellens akutte lymfoblastiske cellelinjer BV173 eller SUP-B15 i IMDM suppleret med 20% FCS, 50 μM p-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære av 5% C02. Telle celler og plate ved 2 x 106 celler / ml i 6 brønner plater, ved 5 ml / brønn. MERK: Suspensjonscellelinjer av forskjellig opprinnelse kan eventuelt brukes. For å arrestere…

Representative Results

Fosforylering av p53 ved rest Ser15 ble vist å være avhengig av ATM-kinaseaktivitet 16 . For å demonstrere og bekrefte spesifisiteten til PLA-teknikken på cytospinpreparater av suspensjoncellekulturer, er det vist at induksjon av DNA-skade ved 2 timers NCS-behandling av BCR-ABL + B-ALL-celler arrestert i G1-fasen av cellesyklusen Resulterte i den spesifikke interaksjonen mellom ATM og fosfor-Ser15-p53, som forventet. Punkterte PLA-signaler ble observert i kjer…

Discussion

I denne rapporten er det påvist at PLA kan brukes til å bestemme og visualisere den spesifikke samspillet mellom proteiner i suspensjonscellekulturer. Av protokollen er protokollen beskrevet her ikke begrenset til studiet av DNA-reparasjonskomplekser, men gjelder også for å visualisere og kvantifisere andre protein-protein-interaksjoner i suspensjonscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med fosforylert p53 i G1-arresterte BCR-ABL + B-ALL-celler når de eksponeres for et DNA-skadefremkallende middel. …

Materials

BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors