حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها<em> في المختبر</em> أداة الفحص في أبحاث السمع
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. ويمكن استخدام هذه التقنية كأداة في المختبر الفحص في سماع البحوث.
Abstract
في حين كان هناك تقدما ملحوظا في سماع البحوث على مدى العقود القليلة الماضية، لا يزال هناك أي علاج لفقدان السمع الحسي العصبي (سنهل)، وهو الشرط الذي ينطوي عادة على الضرر أو فقدان الهياكل الحسية الحسية الدقيقة للأذن الداخلية. ظهرت في المختبر في المختبر وفحص الجسم الحي في السنوات الأخيرة، مما يتيح فرز عدد متزايد من المركبات العلاجية المحتملة مع تقليل الموارد وتسريع الجهود لتطوير علاجات ل سنهل. على الرغم من أن الثقافات المتجانسة لبعض أنواع الخلايا لا تزال تلعب دورا هاما في البحوث الحالية، فإن العديد من العلماء يعتمدون الآن على ثقافات عضلية النمط الأكثر تعقيدا من الأذنين الفئران الداخلية، المعروف أيضا باسم المستكشفات القوقعة. الحفاظ على الهياكل الخلوية المنظمة داخل الأذن الداخلية يسهل التقييم في الموقع من المكونات المختلفة للبنية القوقعة، بما في ذلك خلايا الشعر الداخلية والخارجية، والخلايا العصبية دوامة العقدة، العصبيةإيتس، والخلايا الداعمة. هنا نقدم إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. إن الإعداد الدقيق لهذه المستكشفات يسهل تحديد الآليات التي تسهم في سنهل ويشكل أداة قيمة لمجتمع البحث السمعي.
Introduction
فقدان السمع الحسي العصبي (سنهل) يعكس الأضرار التي لحقت الأذن الداخلية أو الصاعد المسار السمعي. في حين أن فقدان السمع هو العجز الحسي الأكثر شيوعا في البشر 1 ، العلاجات العلاجية لا وجود لها حتى الآن 2 . على الرغم من أن زراعة قوقعة الأذن أو السمع يمكن أن تستعيد درجة معينة من السمع للمرضى الذين يعانون من سنهل شديدة وعميقة، فإن السمع التي تقدمها هذه الأجهزة لا تزال مختلفة جدا عن السمع "الطبيعي"، وخصوصا أثناء محاولات لفهم الكلام في الضوضاء أو للاستماع إلى الموسيقى.
في حين يعتبر انحطاط خلية الشعر منذ فترة طويلة النتيجة الرئيسية للأحداث السمعية الصادمة (على سبيل المثال، التعرض للضوضاء الصاخبة)، وهناك أدلة متزايدة على أن نقاط الاشتباك العصبي التي تنقل المعلومات من خلايا الشعر إلى العصب السمعي هي على الأقل عرضة للصدمات الصوتية 3 ، 4 ، 5 </sup > ، 6 . منذ عتبات قياس السمع البشري، ومعيار الذهب الحالي لتقييم وظيفة السمع، لا تتنبأ الضرر الخلوي محددة في الأذن الداخلية، وهناك حاجة إلى أدوات أكثر دقة للكشف عن انحطاط الخلوي في أقرب وقت ممكن والشروع في العلاج المناسب 7 .
وغالبا ما يتم اختبار علاجات الأدوية الواعدة لفقدان السمع على ثقافات الخلايا المتجانسة في المختبر ، ولكن مثل هذه النظم لا نموذج بدقة المكروية القوقعة. ومن المعروف أن خلايا كوكلار تفرز العوامل الغذائية التي تؤثر على أنواع الخلايا الأخرى داخل القوقعة 8 ، 9 ، وهي عملية حاسمة في الجسم الحي التي فقدت عندما يتم استزراع عضو كورتي 10 ، 11 أو العصبونات العصبية الحلزونية (سغنز) 12 في عزلة أو عندما يتم تحليل علامات الجزيئيةإف "> 13. ومع ذلك، في الدراسات المجراة التي قد تكون ضرورية للتحقق من صحة البيانات في المختبر لإنشاء علاجات جديدة، شخصية لفقدان السمع في السعي من" الطب الدقيق "تتطلب موارد كبيرة والوقت، وهذا أمر مهم خصوصا عند النظر ومقدار الجهد المطلوب من أجل الكمال وأداء الأذن الوسطى أو مستديرة حقن غشاء النافذة مع اختبارات السمع وتشريح لاحق من القوقعة كاملة يتصاعد.فحص كفاءة المركبات الواعدة في الثقافات عضوي النمط السابقين فيفو المعروفة باسم إكسلانتس القوقعة يوفر بديلا اقتصاديا وموثوق بها 14 ، 15 ، 16 ، 17 .
توضح هذه المقالة بروتوكولا يمكن من خلاله إنشاء والحفاظ على وتقييم إكلانتس القوقعة المعالجة. يتم التأكيد على تطبيقات محددة لهذا النموذج، بما في ذلك استخدامه في الفرزمن المركبات العلاجية المحتملة والتقييم المقارن للنواقل الفيروسية للعلاج الجيني. نهج إكسيلانت فيفو السابقين يسمح للباحثين لتصور آثار علاج معين على السكان خلية مختلفة في الموقع ، وتسهيل تحديد آليات نوع خلية محددة وتنقيح لاحق من العلاجات المستهدفة.
عموما، توفر هذه التقنية نموذجا لدراسة القوقعة خارج الجسم الحي مع الحفاظ على الحيوية عبر الحديث بين أنواع الخلايا المختلفة إلى حد كبير التي تتعايش داخل القوقعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب على الباحثين أن يتقنوا تقنية التشريح قبل إجراء التجارب التي تنطوي على إكتشافات قوقعة. وتضرر الخلايا الشعرية عادة أثناء إجراء التشريح في وقت مبكر من منحنى التعلم، وحظة إشكالية خاصة لنزاهتها هي إزالة الغشاء القصبي، الأمر الذي يتطلب أيدي ثابتة، والأدوات المناسبة،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-15-1-0472 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز)، و ومؤسسة نانسي سايلز داي (كمز)، ومركز لور تينيتوس ريزارتش سينتر (كمز). نشكر جيسيكا E. ساغيرز، با للتعليقات الثاقبة على المخطوطة.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. 신경과학. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
