नवजात शिलालेख के रूप में कण्ट्रोलर स्पष्टीकरण तकनीक<em> विट्रो में</em> सुनवाई अनुसंधान में स्क्रीनिंग टूल
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि तैयारी, संस्कृति, उपचार, और नवजात शिशु कन्क्लेयर स्पष्टीकरण के प्रतिरक्षण को प्रदर्शित करना। इस तकनीक का उपयोग अनुसंधान सुनवाई में इन विट्रो स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
पिछले कुछ दशकों में शोध सुनने में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, फिर भी सेंसरिरिअरील हिअरिंग लॉस (एसएनएचएल) के लिए कोई इलाज नहीं है, एक ऐसी स्थिति है जिसमें आमतौर पर आंतरिक कान के नाजुक यंत्रोन्सास संरचनाओं को नुकसान पहुंचाता है या नुकसान होता है। हाल के वर्षों में इन विट्रो और पूर्व विवो assays में परिष्कृत, संभावित चिकित्सीय यौगिकों की बढ़ती संख्या की स्क्रीनिंग को सक्षम करते हुए संसाधनों को कम करते हुए और एसएनएचएल के लिए इलाज विकसित करने के प्रयासों में तेजी लाने के लिए। यद्यपि वर्तमान शोध में कुछ प्रकार की कोशिकाओं के समरूप संस्कृतियां एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती रहती हैं, अब कई वैज्ञानिक म्यूचिन इनर कानों के अधिक जटिल अंगटिपीक संस्कृतियों पर भरोसा करते हैं, जिसे कॉक्लियर स्पैंट्स भी कहा जाता है। आंतरिक कान के भीतर संगठित सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण में कोक्लाअर इंफ्रास्ट्रक्चर के विभिन्न घटकों के मद्देनजर की सुविधा होती है जिसमें आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाओं, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स, न्यूरआईटीएस, और सहायक कोशिकाओं। यहाँ हम तैयारी, संस्कृति, उपचार, और नवजात शिशु कन्क्लेयर स्पष्टीकरण के प्रतिरक्षण को प्रस्तुत करते हैं। इन explants की सावधान तैयारी एसएनएचएल में योगदान करने वाले श्रमिकों की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं और सुनवाई अनुसंधान समुदाय के लिए एक बहुमूल्य उपकरण बनाते हैं।
Introduction
संवेदी सुनवाई हानि (एसएनएचएल) आंतरिक कान या आरोही श्रवण पथ को नुकसान दर्शाती है। जबकि सुनवाई हानि मानव में सबसे सामान्य संवेदी घाटे है 1 , रोगाणुरोधक उपचार अभी तक मौजूद नहीं हैं 2 हालांकि कंचक या श्रवण मस्तिष्क प्रत्यारोपण, गहन एसएनएचएल से गंभीर रोगियों के लिए कुछ हद तक सुनवाई को बहाल कर सकते हैं, इन उपकरणों द्वारा दी गई सुनवाई अब भी "प्राकृतिक" सुनवाई से बहुत भिन्न है, खासकर शोर में भाषण को समझने या संगीत सुनने के प्रयासों के दौरान।
जबकि बाल कोशिका अध: पतन को लंबे समय तक दर्दनाक श्रवण घटनाओं का प्राथमिक परिणाम माना जाता है ( उदाहरण के लिए, जोर से शोर के संपर्क में), इस बात का सबूत बढ़ रहा है कि शल्यक्रिया तंत्रिका के लिए बाल कोशिकाओं से सूचना प्रेषण करने वाले संक्रमण कम से कम ध्वनिक आघात के लिए कमजोर होते हैं 3 , 4 , 5 </sup > , 6 मानव ऑडिओमेट्रिक थ्रेसहोल्ड के बाद से, सुनवाई कार्य के मूल्यांकन के लिए वर्तमान सोने का मानक, आंतरिक कान में विशिष्ट सेलुलर क्षति की भविष्यवाणी नहीं करता है, जितनी जल्दी हो सके सेलुलर अध: पतन का पता लगाने और पर्याप्त उपचार शुरू करने के लिए अधिक परिष्कृत उपकरण आवश्यक हैं।
सुनवाई हानि के लिए फार्मास्यूटिकल उपचार का वादा अक्सर इन विट्रो में समरूप कोशिका संस्कृतियों पर परीक्षण किया जाता है, लेकिन ऐसी व्यवस्थाएं कॉक्लेयर माइक्रोएनेरेंचर को सही तरीके से पेश नहीं करती हैं। कोक्लीयर कोशिकाओं को ट्राफिक कारकों को छिपाने के लिए जाना जाता है जो कोक्ली 8 , 9 के भीतर अन्य कोशिका प्रकारों को प्रभावित करते हैं, जो कि vivo प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है जो कोरर्टी 10 , 11 या स्पायरल गंगलायन न्यूरॉन्स (एसजीएन) 12 के अंग अलगाव में सुसंस्कृत या जब खो जाता है आणविक मार्करों का विश्लेषण किया जाता है13 "हालांकि," विस्टो डेटा की वैधता के लिए आवश्यक " vivo अध्ययन" में आवश्यक हो सकता है कि "सटीक चिकित्सा" की खोज में सुनवाई हानि के लिए नए, व्यक्तिगत उपचार की आवश्यकता होती है, जो महत्वपूर्ण संसाधनों और समय की आवश्यकता होती है। सुनवाई परीक्षणों के साथ मध्य कान या गोल खिड़की के इंजेक्शन को पूरा करने और कन्क्लेयर पूर्ण-माउंट के बाद के विच्छेदन के लिए कितना प्रयास करने की आवश्यकता होती है। कॉंकलिअर एक्सप्लन्ट्स के रूप में जाना जाने वाला ऑर्गोटिपीक पूर्व विवो संस्कृतियों में होनहार यौगिकों का कुशल स्क्रीनिंग एक आर्थिक और विश्वसनीय विकल्प प्रदान करता है 14 , 15 , 16 , 17
यह आलेख एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है जिसके द्वारा उपचारित कॉक्लियर स्पैन्टर्स का निर्माण, रखरखाव और मूल्यांकन किया जाता है। इस मॉडल के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों पर जोर दिया गया है, जिसमें स्क्रीनिंग में इसका उपयोग शामिल हैसंभावित चिकित्सीय यौगिकों के और जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर के तुलनात्मक मूल्यांकन। एक पूर्व विवो स्पष्टीकरण दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को सेल सेल-विशिष्ट तंत्र की पहचान करने और लक्षित चिकित्सीयिकी के बाद के परिशोधन की सुविधा प्रदान करने के लिए, विभिन्न सेल आबादी पर दिए गए उपचार के प्रभाव को कल्पना करने की अनुमति देता है।
कुल मिलाकर, इस तकनीक ने कोक्लेअ एक्स विवो का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान किया है जबकि कोक्लेअ के भीतर मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण क्रॉस-टॉक को संरक्षित करते हुए।
Protocol
Representative Results
Discussion
शोधकर्ताओं ने कोक्लेअर स्पष्टीकरण से जुड़े प्रयोगों से पहले विच्छेदन तकनीक को सही करना होगा। सीखने की अवस्था में शुरू किए गए विच्छेदन के दौरान बाल कोशिकाओं को आमतौर पर क्षतिग्रस्त किया जाता है, और उन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डैफ़नेस एंड अदर कम्युनिकेशन डिसऑर्डर ग्रांट आरएपीडीसी 015824 (केएमएस) और टी 32 डी सी 200038 (एसडी समर्थन करने वाला), रक्षा अनुदान W81XWH-15-1-0472 (केएमएस) विभाग, बर्टारेली फाउंडेशन (केएमएस) द्वारा समर्थित था नैन्सी साइल्स डे फाउंडेशन (केएमएस), और लाउर टिनिटस रिसर्च सेंटर (केएमएस)। हम पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए जेसिका ई। सैपरर्स, बीए का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
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