이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
지난 수십 년 동안 청력 연구가 눈에 띄게 발전했지만, 내이의 민감한 mechanosensory 구조를 손상 시키거나 손상시키는 감각 신경성 청력 손실 (SNHL)에 대한 치료법은 아직 없습니다. 정교한 in vitro 및 ex vivo 분석법이 최근 수년간 출현하여 SNHL 치료법 개발을위한 자원을 최소화하고 치료 노력을 가속화하면서 잠재적으로 치료 화합물의 증가를 시험 할 수있게되었습니다. 특정 세포 유형의 균질 배양이 현재의 연구에서 중요한 역할을 계속하고 있지만, 많은 과학자들은 이제 달팽이 외식 편으로 알려진보다 복잡한 기관 내 배양에 의존합니다. 내이에서 조직화 된 세포 구조를 보존하면 내외부 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런, 신경 세포를 포함한 달팽이관 인프라의 다양한 구성 요소를 현장에서 평가할 수 있습니다.ites 및 지원 세포. 여기에서는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining을 제시합니다. 이러한 explants의주의 깊은 준비는 SNHL에 기여하는 메커니즘의 식별을 용이하게하고 청각 연구 커뮤니티를위한 중요한 도구를 구성합니다.
서론
Sensorineural Hearing Loss (SNHL)은 내이 또는 오름차순 청각 경로의 손상을 나타냅니다. 청력 상실은 인간 1 에서 가장 흔한 감각 결손이지만 치유 요법은 아직 존재하지 않습니다 2 . 인공 와우 또는 청각의 뇌간 이식 물이 심한 SNHL 환자의 청력을 어느 정도 회복시킬 수는 있지만, 이러한 장치가 제공하는 청력은 특히 자연스러운 청력과는 매우 다르며 특히 소음의 말을 이해하거나 음악을 듣는 동안 매우 다릅니다.
유모 세포 변성은 오랫동안 외상성 청각 사건 ( 예 : 시끄러운 소음에 노출)의 주요 결과로 간주되어 왔지만, 유모 세포에서 청각 신경으로 정보를 전송하는 시냅스가 적어도 음향 외상에 취약한 증거가 증가하고 있습니다 3 , 4 , 5 > , 6 . 청각 기능 평가를위한 현재의 금 표준 인 인간의 청력 역치는 내이의 특정 세포 손상을 예측하지 않기 때문에 가....
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프로토콜
연구 프로토콜은 매사추세츠의 눈과 귀의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다.
1. 절개 준비
- 외과 테이블 준비하기
- 수술 테이블을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오.
- 현미경 옆에 두 개의 nonsterile prep pad를 놓습니다.
- 가열 살균 된 작동 가위, 메스칼 핸들, 마이크로 나이프 및 포셉 (# 4 및 # 55 각각 2 개)을 포함하여 도구 트레이를 준비합니다. 악기 쟁반과 50mm의 깨끗한 벽으로 된 유리 바닥의 페트리 접시를 비 살균 패드 위에 놓습니다.
- 살균 된 # 15 메스 블레이드를 얻습니다. 밀봉 가능한 비닐 봉지 또는 용기 (기관 지침에 따라 도체를 처리하는 것); 양동이에 얼음; 및 감기, 무균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS). 이 항목을다른 비 스테로이드 패드.
- 50 ML 플라스틱 실험실 튜브에 HBSS를 전송하고 얼음에 넣어.
- 문화 준비
- 모든 물질을 층류 후드에서 준비하십시오. 4 개의 시편마다....
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결과
많은 프로토콜이 Corti 체외 이식편의 기관에 초점을 맞추고 있지만이 기술은 SGNs를 포함하여 전체 달팽이관의 해부학 구조를 보존하려고 시도합니다. 이것은 연구자들에게 Corti 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경 돌기 및 somata에 대한 주어진 치료의 효과를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 설명 된 것처럼 모 틸리 움의 일부를 보존하는 절개를 수행하는 것은 Corti만의 기관을 외과 적으로 외과하는 것보다 기술적으로 어렵습니다. 그러나 같은 방법론 19 , 20을 사용하여 2 개의 최근 논문에서 전정 신경초종 분비물 ( 그림 1 )과 세포 외 소포를 적용한 후이 부위에서 유의 한 병리학 적 효과가 관찰 되었기 때문에 신경 돌기와 SGN 영역이 중요합니다. 이러한 변화는 Corti explants의 격리 된 기관을 사용하.......
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토론
연구원은 달팽이관 외식에 관련된 실험을하기 전에 해부 기술을 완벽하게해야합니다. 유모 세포는 일반적으로 학습 곡선에서 초기에 수행되는 해부 중에 손상되며, 완전 무결 한 특히 문제가되는 순간은 안정적인 손, 적절한 도구 및 경험이 필요한 tectorial membrane의 제거입니다. 시간과 자원을 절약하기 위해 해부 현미경으로 시각 제어를 수행해야하며 잠재적으로 손상된 부위를 기록해야합니다. 값 비싼 1 차 및 2 차 항체를 사용하는 대신 phalloidin과 같은 값싼 시약이 예비 실험에 더 적합합니다. 약간의 손상된 explants 잠재적으로 여전히 실험 (영향을받지 않은 섹션 분석) 또는 항체의 새로운 조합의 테스트에 대한 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
표본을 옮기는 것은 특히 중요합니다. 왜냐하면 표본의 조각이거꾸로되어 있지 않습니다 (코팅 된 커버 슬립의 안내없이 종종 "떠 다니는"유모 세포가 퇴화 됨). coverslip의 중앙 위치는 모든 추가.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 보조원 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (SD 지원), 국방부의 W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer 이명 연구 센터 (KMS) 등이 있습니다. Jessica E. Sagers, 원고에 대한 통찰력있는 의견에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 항체, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A 항체, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H 항체, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 항체, mouse(IgG2a) | 항체와 관련상품 주식회사 | 75-028 | |
| 항-TuJ1 항체, 마우스 | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak 세포 및 조직 접착제, 5mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, 멸균 | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 세포 배양 접시, 100 x 20mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR 세포 배양 접시, 35 x 10 mm, 내부 링 4 | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR 세포 배양 접시, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, 멸균 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 투명 매니큐어 | 전자 현미경 과학 | 72180 | |
| 투명 벽 유리 바닥 접시 (유리 40mm), PELCO®, 슬리브 / 20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, 원형, 유리, 직경 10mm, 두께 #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| 증류수, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 고포도당, 피루베이트, 글루타민 없음, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 펜치 | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 펜치 (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 에틸 알코올 (EtOH), 순수, 200 proof, 무수, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| 태아 소 세럼 (FBS), 인증, USDA 승인 지역, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | 50 mL 튜브에 부분 표본을 넣고 -20°C에 보관합니다. C freezer |
| 염소 항닭-647 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| 염소 항마우스(IgG)-568 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| 염소 항마우스(IgG1)-568 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| 염소 항마우스(IgG2a)-488 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| 염소 항토끼-488 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, 멸균, EmbryoMax 초순수, 500mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음, 500mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| 뚜껑이 있는 기기 트레이 스테인레스 스틸 | 산중탈 의료 | TechMed4255 | |
| 마이크로 (해부) 칼 – 각도 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 현미경 슬라이드, VistaVision, 컬러 코드, 75 x 25mm(3 x 1"), 1mm 두께, 흰색, | 72 팩, VWR | 16004-382 | |
| N-2 보충(100X), 5mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, 중탄산나트륨 7.5% 용액, 100mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, 수산화나트륨 용액, 1L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating | Scissors Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| 파라포름알데히드 (PFA), 시약 등급, 결정질 | 시그마-알드리치 | P6148 | 사용 전: 온라인에서 사용 가능한 프로토콜에 기반한 표준 운영 절차를 수립하십시오 |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | 사용 전 오토클레이브 |
| 팔로이딘, 알렉사 플루어 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| 준비 패드, 비멸균 | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | 사용 전 오토클레이브 |
| Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave 사용 전 |
| 메스 블레이드 - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| 메스 핸들 - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C 스테레오 현미경 | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 컨포칼 현미경 | Leica | N/A | |
| Triton-X(비이온 계면활성제) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield 형광용 퇴색 방지 장착 매체 | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| 지퍼 백, 재밀봉 가능, 4 x 6'' - 2mm 두께 | 의 집라인 | 0609132541599 |
참고문헌
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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재인쇄 및 허가
