신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em> 체외에서</em> 청력 연구의 스크리닝 도구
Summary
이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.
Abstract
지난 수십 년 동안 청력 연구가 눈에 띄게 발전했지만, 내이의 민감한 mechanosensory 구조를 손상 시키거나 손상시키는 감각 신경성 청력 손실 (SNHL)에 대한 치료법은 아직 없습니다. 정교한 in vitro 및 ex vivo 분석법이 최근 수년간 출현하여 SNHL 치료법 개발을위한 자원을 최소화하고 치료 노력을 가속화하면서 잠재적으로 치료 화합물의 증가를 시험 할 수있게되었습니다. 특정 세포 유형의 균질 배양이 현재의 연구에서 중요한 역할을 계속하고 있지만, 많은 과학자들은 이제 달팽이 외식 편으로 알려진보다 복잡한 기관 내 배양에 의존합니다. 내이에서 조직화 된 세포 구조를 보존하면 내외부 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런, 신경 세포를 포함한 달팽이관 인프라의 다양한 구성 요소를 현장에서 평가할 수 있습니다.ites 및 지원 세포. 여기에서는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining을 제시합니다. 이러한 explants의주의 깊은 준비는 SNHL에 기여하는 메커니즘의 식별을 용이하게하고 청각 연구 커뮤니티를위한 중요한 도구를 구성합니다.
Introduction
Sensorineural Hearing Loss (SNHL)은 내이 또는 오름차순 청각 경로의 손상을 나타냅니다. 청력 상실은 인간 1 에서 가장 흔한 감각 결손이지만 치유 요법은 아직 존재하지 않습니다 2 . 인공 와우 또는 청각의 뇌간 이식 물이 심한 SNHL 환자의 청력을 어느 정도 회복시킬 수는 있지만, 이러한 장치가 제공하는 청력은 특히 자연스러운 청력과는 매우 다르며 특히 소음의 말을 이해하거나 음악을 듣는 동안 매우 다릅니다.
유모 세포 변성은 오랫동안 외상성 청각 사건 ( 예 : 시끄러운 소음에 노출)의 주요 결과로 간주되어 왔지만, 유모 세포에서 청각 신경으로 정보를 전송하는 시냅스가 적어도 음향 외상에 취약한 증거가 증가하고 있습니다 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . 청각 기능 평가를위한 현재의 금 표준 인 인간의 청력 역치는 내이의 특정 세포 손상을 예측하지 않기 때문에 가능한 한 빨리 세포 변성을 감지하고 적절한 치료를 시작하기 위해보다 정교한 도구가 필요합니다.
청력 상실에 대한 유망한 약제 처리법 은 시험 관내 에서 균질 세포 배양 물 에서 종종 시험되지만, 그러한 시스템은 달팽이 미세 환경을 정확하게 모델링하지 않습니다. Cochlear 세포는 Corti 10 , 11 또는 Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 의 기관을 분리하여 또는 배양 할 때 손실되는 중요한 생체 내 과정 인 달팽이관 8,9 에서 다른 세포 유형에 영향을주는 영양 요소를 분비하는 것으로 알려져 있습니다 분자 마커를 분석그러나 "정밀 의학"을 추구하기 위해 생체 외 데이터를 검증하여 청력 상실에 대한 새로운 개인 맞춤 치료법을 확립하는 데 필요한 생체 내 연구는 상당한 자원과 시간을 필요로합니다. 이는 특히 고려할 때 적합합니다 청력 검사와 이어지는 인공 와우의 절개를 통해 중이 중이거나 둥근 창 막 주입을 완벽하게 수행하고 수행하는 데 얼마나 많은 노력이 필요한가 인공 와우로 알려진 체외의 체외 배양에서 유망한 화합물을 효율적으로 스크리닝하는 것은 경제적이며 신뢰할 수있는 대안을 제공합니다 14 , 15 , 16 , 17 .
이 기사에서는 치료 된 달팽이 외식편을 생성, 유지 및 평가하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 모델의 특정 응용 프로그램은 심사에서의 사용을 포함하여 강조됩니다.유전자 치료를위한 바이러스 성 벡터의 비교 평가를 포함한다. ex vivo explant approach는 연구자들이 주어진 세포 치료법 이 다른 세포 집단 에 미치는 영향을 그 자리 에서 가시화 할 수있게하여 세포 유형별 메커니즘의 확인과 그 이후의 목표 화 된 치료법의 정제를 용이하게한다.
전반적으로,이 기술은 달팽이관 내 에서 공존하는 매우 다른 세포 유형 사이의 중요한 혼선을 보존하면서 생체 내 에서 달팽이관을 연구 할 수있는 모델을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구원은 달팽이관 외식에 관련된 실험을하기 전에 해부 기술을 완벽하게해야합니다. 유모 세포는 일반적으로 학습 곡선에서 초기에 수행되는 해부 중에 손상되며, 완전 무결 한 특히 문제가되는 순간은 안정적인 손, 적절한 도구 및 경험이 필요한 tectorial membrane의 제거입니다. 시간과 자원을 절약하기 위해 해부 현미경으로 시각 제어를 수행해야하며 잠재적으로 손상된 부위를 기록해야합니다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 보조원 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (SD 지원), 국방부의 W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer 이명 연구 센터 (KMS) 등이 있습니다. Jessica E. Sagers, 원고에 대한 통찰력있는 의견에 감사드립니다.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
References
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