Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Son birkaç on yılda yapılan işitme araştırmalarında dikkate değer ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, tipik olarak iç kulaktaki hassas mekano-algılama yapılarına hasar veren veya kaybedilen bir durum olan Sensorineural İşitme Kaybı (SNHL) için herhangi bir tedavi yoktur. Son yıllarda sofistike in vitro ve ex vivo testler ortaya çıkmış ve kaynakları azaltmak ve SNHL için iyileştirme çabalarını hızlandırırken potansiyel olarak terapötik bileşiklerin sayısının artmasını mümkün kılmıştır. Bazı hücre türlerinin homojen kültürleri günümüz araştırmalarında önemli rol oynamaya devam etse de, birçok bilim adamı şimdi koklear eksplant olarak da bilinen daha kompleks organometalik faregiller arası kulak kültürlerine güveniyor. Organik hücresel yapıların iç kulak içinde korunması, iç ve dış kıl hücreleri, spiral ganglion nöronları, sinir hücreleriItes ve destekleyici hücreler. Burada neonatal farelerde koklear eksplantların hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanması sunulmuştur. Bu eksplantların dikkatli bir şekilde hazırlanması, SNHL'ye katkıda bulunan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve işitme araştırmaları topluluğu için değerli bir araç teşkil eder.
Sensorinöral İşitme Kaybı (SNHL), iç kulakta veya artan işitme yolunda hasar olduğunu gösterir. İşitme kaybı, insanlardaki en yaygın duyusal eksiklik iken, küratif terapiler henüz mevcut değildir 2 . Koklear veya işitsel beyin sapı implantları ağır derecede derinlemesine SNHL olan hastalara bir dereceye kadar işitme becerisi kazandırabilmesine rağmen, özellikle de sesli konuşmayı anlamaya veya müzik dinlemeye çalışırken, bu cihazların sağladığı işitme "doğal" işitme durumundan çok farklıdır.
Saç hücresi dejenerasyonu, uzun süredir travmatik işitsel olayların ( örneğin, yüksek gürültüye maruz kalma) birincil sonuç olarak düşünülürken , bilginin saç hücrelerinden işitme sinirine iletildiği sinapsların en azından akustik travmaya karşı savunmasız olduğu yönünde artan bir kanıt vardır 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . İşitsel işlevi değerlendirmek için kullanılan altın standart olan insan odyometrik eşikleri, iç kulaktaki belirli hücresel hasarı öngörmemektedir, mümkün olduğunca çabuk hücresel dejenerasyonu saptamak ve uygun tedaviyi başlatmak için daha rafine edilmiş araçlar gerekmektedir.
İşitme kaybı için umut verici farmasötik tedaviler genellikle homojen hücre kültürleri üzerinde in vitro olarak denenir, ancak bu tür sistemler koklear mikro çevreyi doğru bir şekilde modellememektedir. Koklear hücrelerin Corti 10 , 11 ya da Spiral Ganglion Nöronları (SGNs) 12 organı izole edildiğinde ya da ne zaman ne de olsa, koklea 8 , 9 içindeki diğer hücre tiplerini etkileyen trofik faktörleri salgılarlar. Moleküler belirteçler analiz edilirEf "> 13. Bununla birlikte," hassas tıp "arayışında işitme kaybı için yeni ve kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak için in vitro verilerin geçerliliği için gerekli olabilecek in vivo çalışmalar önemli kaynaklara ve zamana ihtiyaç duymaktadır. Işitme testleri ve müteakip koklear tüm montajların diseksiyonu ile orta kulak veya yuvarlak pencere membran enjeksiyonlarını mükemmelleştirmek ve gerçekleştirmek için ne kadar çaba gerekir? Koklear eksplant olarak bilinen organotipik ex vivo kültürlerde umut verici bileşiklerin verimli taranması, ekonomik ve güvenilir bir alternatif sağlar 14 , 15 , 16 , 17 .
Bu makalede, tedavi edilen koklear eksplantların üretilmesi, sürdürülmesi ve değerlendirilmesi için kullanılan bir protokol açıklanmaktadır. Taramada kullanımı da dahil olmak üzere, bu model için özel uygulamalar vurgulanmaktadırPotansiyel olarak terapötik bileşikler ve gen terapisi için viral vektörlerin karşılaştırmalı değerlendirmesi. Bir ex vivo eksplant yaklaşımı, araştırmacıların belirli bir tedavinin etkilerini , in situ olarak farklı hücre popülasyonları üzerinde görselleştirmesini ve hücre tipine özgü mekanizmaların tanımlanmasını ve daha sonra hedeflenen terapötiklerin arıtılmasını kolaylaştırır.
Genel olarak, bu teknik, kokleada bir arada bulunan çok çeşitli hücre tipleri arasındaki yaşamsal çapraz konuşmayı korurken, kokleayı ex vivo çalışmak için bir model sağlar.
Araştırmacılar, koklear eksplantları içeren deneyleri yapmadan önce diseksiyon tekniğini mükemmelleştirmelidirler. Saç hücreleri, öğrenme eğrisinin başlarında gerçekleştirilen diseksiyonlar sırasında sıklıkla hasar görürler ve bütünlüğü için özellikle sorunlu bir an, sabit eller, uygun araçlar ve deneyim gerektiren, tectorial membranın çıkarılmasıdır. Zamandan ve kaynaklardan kazanmak için diseksiyon mikroskopu altında görsel bir kontrol yapılmalı ve potansiyel olarak hasar gö…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) tarafından desteklenmiştir. Nancy Sayles Day Vakfı (KMS) ve Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS). Yazı hakkında anlayışlı yorumlar için BA'ya Jessica E. Sagers'e teşekkür ediyoruz.
Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |