Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования
Summary
Конкурентные тесты пептидов широко используются в различных молекулярных и иммунологических экспериментах. В этом документе описывается подробный метод анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ и соответствующие процедуры валидации, которые могут быть полезны для поиска специфических сайтов фосфорилирования.
Abstract
Фосфорилирование белков в определенных местах определяет его конформацию и взаимодействие с другими молекулами. Таким образом, фосфорилирование белка влияет на биологические функции и характеристики клетки. В настоящее время наиболее распространенным методом обнаружения сайтов фосфорилирования является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС), быстрый и чувствительный метод. Однако относительно лабильные фосфатные фрагменты часто высвобождаются из фосфопептидов во время стадии фрагментации, что часто приводит к ложноотрицательным сигналам. В таких случаях традиционный анализ киназы in vitro с использованием сайт-направленных мутантов был бы более точным, но этот метод является трудоемким и трудоемким. Поэтому альтернативный способ с использованием пептидной конкуренции может быть предпочтительным. Установлен мотив консенсусного распознавания 5'-аденозинмонофосфат-активированной протеинкиназы (AMPK) 1 и он был подтвержден с помощью библиотеки позиционного сканирующего пептида assAy 2 . Таким образом, сайты фосфорилирования AMPK для нового субстрата могут быть предсказаны и подтверждены с помощью конкурентного анализа пептидов. В этом отчете мы описываем подробные этапы и процедуры анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ, иллюстрируя AMPK-опосредованное фосфорилирование эритроидного фактора 2 (Nrf2), связанного с эритроидным фактором фактора II. Для аутентификации сайта фосфорилирования мы проводили последовательный анализ киназы in vitro с использованием сайт-специфического мутанта. В целом, конкурентный анализ пептидов дает способ скрининга нескольких потенциальных сайтов фосфорилирования и идентификации сайтов для валидации с помощью мутантов сайта фосфорилирования.
Introduction
Фосфорилирование белка у конкретного остатка играет значительную роль в широком диапазоне клеточных процессов. Таким образом, понимание сигнальных сетей требует идентификации конкретных сайтов фосфорилирования. Кроме того, сайт фосфорилирования определяет влияние на функцию белка, поскольку отдельные домены в пределах белка обладают различными структурами и функциями. Активность фактора фактора 2 эритроидного фактора 2 (Nrf2) ядерного фактора, ключевого антиоксидантного транскрипционного фактора, регулируется двунаправленным образом посредством фосфорилирования в разных местах. Наши исследования были сосредоточены на киназах, которые катализируют фосфорилирование Nrf2. Реакция стресса Nrf2 против окислительного заражения происходит быстро, главным образом за счет фосфорилирования на серине 40 и опосредованного протеинкиназой C (PKC) -δ, которая активирует Nrf2 3,4 . Напротив, Fyn катализирует тормозное фосфорилирование Nrf2 при тирозине 568 для строгого контроля за деятельностью 5 .
Наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения сайтов фосфорилирования, является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС). Быстрые и высокочувствительные данные картирования сайта фосфорилирования могут быть получены таким образом; Однако он имеет несколько технических ограничений, часто генерирующих ложноотрицательные сигналы. Плохое покрытие последовательностей часто происходит при анализе ЖХ / МС. Для идентификации сайтов фосфорилирования требуется информация о максимальном покрытии белками аминокислот 6 . Протеолиз белка, представляющего интерес, с несколькими протеазами во время стадии пищеварения может помочь в улучшении охвата последовательностей. Другим препятствием для идентификации остатков фосфорилирования является легкая потеря фосфорной кислоты, которая часто наблюдается для сериновых и треонинфосфорилированных пептидов 6 , 7 . Лабильные фосфатные группы частоВысвобождается из фосфопептидов в процессе фрагментации 7 . Второй вариант при поиске сайтов фосфорилирования заключается в использовании пептидного микроматричного метода. Возможно проводить скрининг на целевые сайты киназ с использованием чипа микрочипов, содержащего пептидные фрагменты, полученные из представляющего интерес белка. Однако из-за требований к оборудованию для производства и обнаружения микрочипов, метод пептидных микроматриц считается отнимающим много времени и дорогостоящим.
Для преодоления этих трудностей для протеинкиназы с известными мотивами распознавания может быть использован анализ in vitro -конкурирующих киназ in vitro . Если устанавливается мотив консенсусного распознавания киназы, предполагаемые сайты фосфорилирования субстрата-кандидата могут быть предсказаны, и аутентичность сайтов может быть подтверждена. Наиболее убедительным методом для этой процедуры является показать отмену фосфорилирования в мутантном белке, в котором предикатD остаток замещен нефосфорилируемой аминокислотой ( т.е. серин или треонин-аланин, тирозин-фенилаланин). Однако производство и выделение мутантных белков требует много времени. В качестве альтернативы на начальном этапе исследования конкурентный тест пептид-киназы является простым и удобным. Здесь мы опишем протокол для конкурентного анализа пептида in vitro и для проверки сайта фосфорилирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В качестве простого и удобного способа оценки достоверности предсказанных сайтов фосфорилирования, опосредованных AMPK, здесь мы описываем киназный анализ in vitro , который может быть использован для обнаружения конкретного участка фосфорилирования с использованием конкурентных п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемым правительством Кореи (MSIP) (№ 2015R1A2A1A10052663 и № 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
