Murine Kortaxel Ventrikulär Hjärtskivor för Elektrofysiologiska Studier
Summary
Här beskriver vi förberedelsen av livskraftiga ventrikulära skivor från vuxna möss och deras användning för skarpa elektrodverkningspotentialinspelningar. Dessa multicellulära preparat ger en bevarad in vivo liknande vävnadsstruktur, vilket gör dem till en värdefull modell för elektrofysiologiska och farmakologiska studier in vitro .
Abstract
Murinska kardiomyocyter har använts i stor utsträckning för in vitro- studier av hjärtfysiologi och nya terapeutiska strategier. Flercelliga preparat av dissocierade kardiomyocyter är dock inte representativa för den komplexa in vivo strukturen av kardiomyocyter, icke-myocyter och extracellulär matris, vilken påverkar både mekaniska och elektrofysiologiska egenskaper hos hjärtat. Här beskriver vi en teknik för att förbereda livskraftiga ventrikulära skivor av vuxna mushjärtor med en bevarad in vivo- liknande vävnadsstruktur och visa deras lämplighet för elektrofysiologiska inspelningar. Efter excision av hjärtat separeras ventriklarna från atrierna, perfusioneras med Ca2 + -fri lösning innehållande 2,3-butandionmonoxim och inbäddad i ett 4% lågmältat agarosblock. Blocket placeras på en mikrotom med ett vibrerande blad, och vävnadsskivor med en tjocklek av 150-400 μm är beredda för att hålla vibrationen friBladets sväng vid 60-70 Hz och förflyttar bladet framåt så långsamt som möjligt. Skivans tjocklek beror på den ytterligare applikationen. Skivor lagras i iskall Tyrode lösning med 0,9 mM Ca 2+ och 2,3-butandionmonoxim (BDM) i 30 min. Efteråt överförs skivor till 37 ° C DMEM i 30 minuter för att tvätta BDM. Skivor kan användas för elektrofysiologiska studier med skarpa elektroder eller mikroelektroder, för kraftmätningar för att analysera kontraktil funktion eller för att undersöka interaktionen mellan transplanterade stamceller härledda kardiomyocyter och värdvävnad. För skarpa elektrodinspelningar placeras en skiva i en 3 cm-cellkulturskål på värmeplattan i ett inverterat mikroskop. Skivan stimuleras med en unipolär elektrod, och intracellulära aktionspotentialer av kardiomyocyter i skivan registreras med en skarp glaselektrod.
Introduction
Tunna vävnadsskivor har använts ofta i grundvetenskapen, eftersom Yamamot och Mcllwain visade 1966 att elektrisk aktivitet av hjärnskivor upprätthålls in vitro 1 . Sedan dess har elektrofysiologiska och farmakologiska studier utförts på skivor från hjärna 2 , lever 3 , lung 4 och myokardvävnad 5 , 6 , 7 . Första patch-clamp-inspelningar i ventrikulära skivor från neonatala råtthjärtor beskrivs i 1990 8 , men denna teknik föll i oblivion under en tid. Mer än ett decennium senare etablerade vår grupp en ny metod för att förbereda murina embryonala 9 , neonatala 10 och vuxna 11 hjärtskivor. Dessa livsdugliga vävnadsskivor kan användas för akuta experiment (vuxenskivaS kan odlas i flera timmar) eller kortsiktiga odlingsexperiment (embryonala och neonatala skivor kan odlas i några dagar). Skivor visar in vivo som elektrofysiologiska egenskaper och en homogen excitationsspridning som bedömts av skarp elektrodverkningspotential och mikroelektroduppsättning 11 . På grund av sin "tvådimensionella" morfologi tillåter de direkt inspelningselektroder till alla områden i ventrikeln, vilket gör dem till ett intressant verktyg för elektrofysiologiska undersökningar och väcker nya experimentella alternativ i jämförelse med Langendorff-perfuserade hela hjärtan. Läkemedelsreaktion av skivorna till jonkanalblockerare som verapamil (L-typ Ca 2+ -kanalblockerare), lidokain (Na + -kanalblockerare), 4-aminopyridin (icke-selektiv spänningsberoende K + -kanalblockerare) och linopirdin (KCNQ K + -kanalblåsare) 9 , 11 </suP> motsvarade kända effekter på dissocierade kardiomyocyter. Isometriska kraftmätningar avslöjade ett positivt kraftfrekvensförhållande och föreslog starkt intakt sammandragsfunktion 10 . Dessa fynd visade att murina ventrikulära skivor är lämpliga som en in vitro vävnadsmodell för fysiologiska och farmakologiska studier. Vidare har ventrikulära skivor av mottagarhjärtan i kombination med skarpa elektrodinspelningar visat sig vara ett mycket användbart verktyg för att karakterisera elektrisk och mekanisk integration samt mognad av transplantatfoster 12 , 13 , 14 och stamceller härledda 15 kardiomyocyter.
Sammanfattningsvis är ventrikulära skivor en värdefull och väl etablerad multicellulär vävnadsmodell och bör anses vara komplementär till dissocierade kardiomyocyter och Langendorff-perfuserade hjärtanI kardiovaskulär forskning, med den största fördelen att tillhandahålla en in vivo- liknande vävnadsstruktur (i motsats till dissocierade celler) samt direkt åtkomst av mätteknik som skarpa elektrodinspelningar till alla hjärtområdena (i motsats till helhjärtans beredningar).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventrikulära skivor möjliggör elektrofysiologiska, farmakologiska och mekaniska studier med en bevarad in vivo- liknande vävnadsstruktur och direkt åtkomst av mättekniken till alla hjärtområdena. Fysiologiska verkningspotentialegenskaper har påvisats i embryonala, neonatala och vuxna skivor 9 , 10 , 11 . Skivans vitalitet, med undantag för ytskikten som är direkt skadad av skivproceduren, har bekräftats av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar det stöd som ges av Neurofysiologiska institutets verkstäder och djuranläggning. Detta arbete stöddes av Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune och Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
