Vi beskriver en eksperimentell teknikken som vi kaller minimalt invasiv muskel innebygging (MIME), som er basert på bevis at skjelettlidelser muskelvev inneholder levedyktig myogenic celler som kan lette donor-celle-mediert myogenesis når implantert i en vert muskel.
Skjelettmuskel besitter regenerativ kapasitet fordi vev-resident, muskel fiber-genererer (myogenic) satellitt celler (SCs), som kan danne nye muskelfibre under de rette forholdene. Selv om SCs kan høstes fra muskelvev og kultivert i vitro, er resulterende myoblast cellene ikke veldig effektivt for å fremme myogenesis når transplantert inn i vert muskel. Kirurgisk utsette vert muskelen og pode segmenter av donor muskelvev eller isolert muskelfibre med deres SCs på verten muskler, fremmer bedre myogenesis sammenlignet med myoblast transplantasjon. Vi har utviklet en ny teknikk som vi kaller minimalt invasiv muskel innebygging (MIME). MIME innebærer passerer en kirurgisk nål gjennom vert muskelen, tegne et stykke donor muskelvev gjennom nål sporet og la donor vevet innebygd i vert muskler slik at den kan fungere som en kilde til SCs for verten muskelen. Her beskrive vi i detalj trinnene involvert i å utføre MIME i en immunodeficient musemodell som uttrykker en grønn fluorescerende protein (GFP) i alle cellene. Immunsvikt vert musen reduserer risikoen for uimottakelig avvisning av donor vev, og GFP kan lett identifikasjon av verten muskel fiber (GFP +) og donor-cell-derived muskel fiber (GFP-). Våre forsøksdata foreslår at MIME kan brukes å implantatet en extensor digitorum longus (EDL) muskel fra en donor mus inn i tibialis fremre (TA) muskelen vert museklikk. Våre data foreslår også at når en myotoxin (barium klorid, BaCl2) injiseres inn i vert muskelen etter MIME, det er bevis på donor-cell-derived myogenesis i vert muskler, med ca 5%, 26%, 26% og 43% av fibrene i en enkelt vert TA muskel viser ingen vert bidrag, minimal vert bidrag, moderat vert bidrag og maksimal vert bidrag, henholdsvis.
Sunn skjelettmuskulatur, selv etter mitotisk, har utmerket regenerativ kapasitet av vev-resident myogenic celler kjent som satellitt celler (SCs)1,2; og vurdert i3,4. Men under patologiske tilstander forårsaket av muscular dystrophies, traumer eller akselerert aldring, muskel fornyelse kan ikke holde tritt med muskel sammenbrudd, og dermed progressiv muskel fiber brutt5. Selv om effektive metoder har blitt utviklet for å isolere SCs fra muskel og utvide dem i kultur generere store antall myoblasts (og senere myotubes), har forsøk på å generere fysiologisk relevante antall muskelfibre i vert muskel gitt bare minimal suksess6. Som med mange andre celletyper, når myoblasts blir injisert alene i vert vev, de fleste av cellene ikke engraft7,8. Vi har vist at nevromuskulær elektrisk stimulering (NMES) muliggjør donor-cell-derived myogenesis i gjenfødelse dårlig vert musen muskler som ble injisert med menneskelig myoblasts8. Andre har vist at kirurgisk pode biopsied muskel eller enkelt muskelfibre med vedlagte SCs, lette moderat myogenesis selv uten NMES, antyder at implanting hele muskelfibre med SCs kan være mer fordelaktig enn implanting myogenic celler alene9,10. Siden donor eller utviklet muskelvev podet vert muskel gir bedre resultater enn transplanting celler alene, er det mulig at vev eller vev-lignende strukturer kan gi avgjørende signaler for giver-cellers engraftment; et konsept som blir stadig tydeligere i celle-terapi studier som involverer ulike cellen typer10,11,12.
Siste data tyder på at SCs fra mennesker mer enn 2 uker post mortem generere myotubes i kultur13. Derfor ønsker vi å vurdere om implantering av muskel vev høstet evaluering i et levende vert vil reversere tap av muskel fiber. Vi har utviklet en ny teknikk som kalles MIME å implantatet donor muskelvev i skjelettlidelser muskelvev til en levende vert for å fremme donor-cell-derived myogenesis. MIME innebærer passerer en kirurgisk nål gjennom vert muskler til å opprette en nål spor; tegne en liten del av donor muskelvev gjennom nål banen; forlate donor vevet innebygd i vert muskelen; og lukking pinnen hullene med vev lim. Når praktiserende teknikken i euthanized mus studerte andre eksperimenter, vi har nå utført MIME i levende mus som er immunodeficient og overalt express en grønn fluorescerende protein (GFP) og oppfølging på 3 til 14 dager etter MIME. På 3 dager etter MIME bekrefte vi at donor musen (GFP-) EDL muskler implantert i vert mus (GFP +) TA muskler, forblir i vert muskelen. På 14 dager etter MIME, bekrefte etter BaCl2 myotoxin skade å indusere skade og myogenesis, vi at ca 5%, 26%, 26% og 43% av fibrene i en enkelt vert TA muskel viser ingen vert bidrag, minimal vert bidrag, moderat vert bidrag, og maksimal vert bidrag, henholdsvis. Sentrale nucleation (en markør av degenerasjon og påfølgende gjenfødelse) er sett i omtrent 95% av TA muskelfibre etter MIME og myotoxin injeksjon.
Vi studerer TA muskler 14 dager etter MIME + BaCl2 fordi dette tidspunkt fanger det mellomliggende stadiet av gjenfødelse, når et flertall av gjenfødte fibrene er en sentral nucleated. Vi studerer GFP + mus som vertskap for MIME, slik at når vi til slutt transplantasjon menneskelige cadaveric muskel i vert mus, vi vil kunne enkelt skille muskelfibre vert og donor opprinnelse. Vi bruker musen EDL muskel som eksperimentelle donor vevet, siden enkelt fibre fra denne muskelen har vist større myogenic potensial enn TA muskler9. EDL muskelen er også synergistisk til TA muskel og har lignende fiber-type sammensetning. Våre foreløpige data tyder på at MIME er i stand til å tilrettelegge donor-cell-derived myogenesis i vert muskelen.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for den eksperimentelle teknikken kalles MIME, utviklet i vårt laboratorium, til implantatet donor muskelvev inn vert muskelvev. Dette er en tilpasning av en åpen muskel pode teknikk som allerede har vist seg for å være effektive i å fremme donor-celle-mediert myogenesis i en vert muskel9,10,17.
Målet med MIME er ikke å aktivere engraftment av donor muskelvev seg inn i vert muskelen (nå ikke vet vi om dette skjer), men heller å gi en kilde av donor SCs som kan bidra til myogenesis i vert muskelen under forhold som stimulerer m uscle regenerering. Vårt håp er at etter MIME er optimalisert og testet i grunnleggende og prekliniske studier, det kan gi verdifull innsikt for å veilede klinisk behandling å øke muskel fornyelse i skjelettmuskulatur som har gjennomgått myogenic muskel tap.
Det er mange spørsmål som har ennå å bli besvart om hvordan MIME kan oversettes til en klinisk terapi, for eksempel: hvordan ville vi kontrollere kvaliteten på donor vev? Hvordan ville vi styrer uimottakelig avvisning av donor vev og celler? Tømmes donor vevet etter gir celler for myogenesis eller det etterlate en fibrotiske arr? Påvirker giver og/eller -muskel fiber type donor-celle-mediert myogenesis? Der musklene kan praktisk nytte MIME? Vi utvide nå våre studier for å vurdere om MIME er trygg og effektiv, identifisere Tilleggsbehandling behandlinger som kan øke donor-avledet myogenesis, og svare på mange av spørsmålene, ovenfor.
Etter endt våre tester av musen til mus allogene transplantasjon med MIME, er vår neste skritt å utføre menneske-til-mus MIME med cadaveric menneskelig vev for å evaluere myogenic potensialet i cadaveric muskelvev. Vi forventer at disse eksperimentene vil føre til en ny linje av grunnleggende og translasjonsforskning forskning, som involverer muskelvev fra givere, som er registrert i tiltak som kroppen arv programmet for utdanning og livets gave programmet for organdonasjon .
Representant dataene presenteres i dette manuskriptet foreslår at på 14 dager etter MIME, det er flere levedyktig myofibers som mangler GFP eller har lave nivåer av GFP. Vår tolkning av disse dataene er at GFP-giver satellitt celler bidratt til myogenesis i vert muskelen. Vi utførte dette eksperimentet i forberedelse til implantering av menneskelig cadaveric vev til en vert musen muskler. For å demonstrere utvetydig at donor satellitt cellene bidra til myogenesis i vert muskelen følgende MIME, ville det være nyttig å implantatet donor vev som uttrykker fluorescerende reporter, som kan være lett skilles fra GFP (f.eks, rød fluorescerende protein uttrykke donor vev implantert i GFP + vert muskel).
Denne teknikken er hovedsakelig begrenset natur SCs i donor vevet. Hvis SCs i donor vevet er levedyktig, teknikken er sannsynlig å lette donor-celle-mediert myogenesis, mens hvis de ikke er levedyktig, myogenesis kan ikke forekomme. Men siden SCs er svært fleksibel og er levedyktig for evaluering av ca 2 uker, er det svært sannsynlig at for eksperimentelle formål, donor vev som er implantert innen få minutter etter innhøsting vil lette donor-celle-mediert myogenesis13 . I tillegg som antydet ovenfor, er det mulig at siden hele muskelvev (som inneholder SCs, modne muskel fiber, samt muskel-resident fibroblaster) er innebygd i vert muskler, fibrose kan oppstå. Men må forutsetningen undersøkes empirisk. Litteratur om muskel skader fra skadelig sammentrekninger, cryoinjury og eksperimentell myotoxins, antyder at immunceller (hovedsakelig makrofager) er i stand til å effektivt fjerne mobilnettet rusk fra skadede fiber og ombygging av ekstracellulær matrix18. Derfor er det mulig at etter MIME og BaCl2 injeksjon, som immunceller som vert har tilgang til degenereres donor muskel fiber, de kan fjerne rusk, etterlot bare donor SCs. Endelig, omfanget av donor-avledet myogenesis er avhengig av mengden av donor muskelvev som er innebygd i vert muskelen. For at verten muskel rommet å være helt nytt av donor-cell-derived myofibers, ville det kreve en metode som X – eller gamma-bestråling å ablate vert muskel SCs og også krever gjentatte MIME-prosedyrer.
Det har blitt demonstrert at kirurgisk utsette en vert muskel og suturing en del av donor på verten muskelen kan rette donor-celle-mediert myogenesis9,10,17. Denne åpne kirurgisk tilnærming er brukt i siste til å spore fremdriften for myogenesis og generere musen modeller av menneskelig muskel sykdommer. Det nyskapende aspektet av MIME-teknikken er at det er minimal invasiv og ikke involverer kirurgisk utsette vert muskelen. Dette reduserer risikoen for iatrogenic infeksjon og graden av ubehag i vert dyr, derfor gjør det mer praktisk å utføre MIME gjentatte ganger på samme vert muskelen hvis nødvendig.
Vi forventer at MIME-teknikken kan være et egnet raffinement til den åpne kirurgisk tilnærmingen som for øyeblikket følges for å implantatet donor muskelvev i en host-mus. Dette kan fremskynde generering av humanized musen modeller, ved å bygge biopsied menneskelige muskel i vert musen muskler. I tillegg forventer basert på våre foreløpige data fra mus til mus pode, vi at MIME vil være effektiv for å oppnå donor-celle-mediert myogenesis fra menneskelige cadaveric donor vev som donor SCs er levedyktig. Til slutt, med ytterligere testing og validering, vi håper at MIME-teknikken vil bidra til å utvikle nye behandlinger for å lette donor-celle-mediert myogenesis hos mennesker med muskel sykdommer.
Suksessen til MIME-teknikken er kritisk avhengig nettopp innebygging donor vevet fascial batterirommet (epimysium) av verten muskel. Hvis giveren vevet er plassert i vert muskel rommet, vil det kunne gi SCs til verten muskel på en presis måte. Hvis giveren vevet er plassert utenfor vert muskelen, er det uklart hva ville være sin skjebne. I vår eksperimentell modell for MIME bruker vi TA muskelen som vert muskler, siden det er fremtredende og overfladisk plassert i det anterolaterale aspektet i beinet. Størrelsen, retningen og anatomisk posisjon av TA muskler, gjør det enkelt å bekrefte at donor vevet er plassert riktig i vert TA muskelen etter MIME. I dette papiret, vi tilbyr eksperimentelle bevis som donor vevet restrømnettet innebygd i verten TA muskel på tre dager etter MIME, og at det er giver-celle-mediert myogenesis i vert muskelen på 14 dager etter MIME.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble gjort mulig av en Pilot bevilgning fra Alliansen for regenerativ rehabilitering forskning og opplæring (AR3T) og en fakultetet oppstart pakke fra Wayne State University til JAR. AR3T støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health Human Development (NICHD), National Institute av nevrologiske lidelser og strek (NINDS), og National Institute for biomedisinsk bildebehandling og bioteknologi (NIBIB ) av de nasjonale instituttene for helse under prisen nummer P2CHD086843. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |