JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

כימות פיגמנטציה בטן ב<em> תסיסנית מלנוגאסטר</em

Published: June 01, 2017
doi:
10.3791/55732
,
1Department of Biology,Lake Forest College

Summary

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

Abstract

פיגמנטציה היא תכונה פשוטה מבחינה מורפולוגית אך משתנה מאוד שלעתים קרובות יש לה משמעות מסתגלת. היא שימשה באופן נרחב כמודל להבנת ההתפתחות והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. פיגמנטציה בטן ב תסיסנית melanogaster היה שימושי במיוחד, המאפשר לחוקרים לזהות את loci כי ביסודו inter- ו intrapecific וריאציות במורפולוגיה. עם זאת, עם זאת, d. melanogaster פיגמנטציה בטן כבר assayed במידה רבה מבחינה איכותית, באמצעות ניקוד, ולא כמותי, אשר מגביל את צורות ניתוח סטטיסטי שניתן להחיל על נתונים פיגמנטציה. עבודה זו מתארת ​​מתודולוגיה חדשה המאפשרת כימות של היבטים שונים של דפוס פיגמנטציה הבטן של המבוגר ד melanogaster . הפרוטוקול כולל הדגימה הדגימה, לכידת תמונה, מיצוי נתונים, וניתוח. כל התוכנה המשמשת לכידת תמונות וניתוח מאקרו תכונהשנכתב עבור ניתוח תמונות קוד פתוח. היתרון של גישה זו היא היכולת למדוד במדויק תכונות פיגמנטציה באמצעות מתודולוגיה כי הוא לשחזור מאוד על פני מערכות הדמיה שונות. בעוד הטכניקה שימשה למדידת וריאציה של דפוסי הפיגמנטציה טרגאל של המבוגר ד melanogaster , המתודולוגיה היא גמישה וישימה רחב על דפוסי פיגמנטציה במספר עצום של אורגניזמים.

Introduction

פיגמנטציה מראה וריאציה פנוטיפית עצומה בין מינים, אוכלוסיות, יחידים, ואפילו בתוך אנשים במהלך אונטוגני 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות שיש מספר רב של מחקרים על פיגמנטציה במגוון רחב של בעלי חיים, פיגמנטציה אולי למד הכי טוב ב תסיסנית melanogaster , שבו מלוא העוצמה של גנטיקה מולקולרית שימש כדי להבהיר את המנגנונים ההתפתחותיים והפיזיולוגיים להסדיר פיגמנטציה וכיצד מנגנונים אלה מתפתחים 1 , 6 . הרבה ידוע על הגנים המסדירים את הסינתזה הביוכימית של פיגמנטים בד. מלנוגאסטר 7 , 8 והגנים השולטים בדיאטה הזמני והמרחביהפצה של ביוסינתזה זו 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . יתרה מזאת, מיפוי גנטי זיהה את הלוקים הגנטיים שעמדו ביסוד ההבדלים הבין-בין-אישיים בפיגמנטציה ב- d melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . כמו כן נבדקו היחסים בין פיגמנטציה לבין תכונות פליאוטרופיות, כגון התנהגות 18 , 19 וחסינות 19 , 20 , כמו גם המשמעות האדפטיבית של דפוסי פיגמנטציה 15 , 21 , 22 . ככזה, פיגמנטציה ב מלנוגאסטר התפתחה כמו מ 'חזק אך פשוטOdel לפיתוח ואבולוציה של פנוטיפים מורכבים.

פיגמנטציה אצל מבוגרים ד מלנוגאסטר מאופיין על ידי דפוסים שונים של מלניזציה על פני הגוף, במיוחד על הכנפיים ועל החזה הגב והבטן. זה הפיגמנטציה של כל צלחת cuticular (tergite) על הבטן הגב, עם זאת, כי קיבל את תשומת הלב המחקרית ביותר. יש וריאציה ניכרת פיגמנטציה זו ( איור 1A- F ), בגלל הן גנטי 17 , 23 ו 24 סביבתיים , 25 גורמים. לציפורן של tergite הבטן מורכב תאים התפתחותיים הקדמי אחורי ( איור 1G ), שכל אחד מהם ניתן לחלק נוסף בהתאם בהתאם פיגמנטציה וקישוט 26 . התא הקדמי כולל שישה cuticleסוגים (a1-a6), ואת התא האחורי כולל שלושה (p1-p3) ( איור 1G ). מבין אלה, את p1, p2, ו a1 cuticle הם בדרך כלל מקופל תחת tergite ב abdomens un-stretched כך שהם מוסתרים. הציפורן הנראית לעין מאופיינת על ידי רצועה של פיגמנטציה כבדה, הנקראת כאן "רצועת פיגמנט", המורכבת מטיפוסים מסוג A4 (שעיר עם זיפים מתונים) ו- A5 (שעיר עם זיפים גדולים), עם הקצה האחורי של הלהקה פיגמנט אינטנסיבי יותר מהקצה הקדמי ( איור 1G ). קדמית להקה זו הוא אזור של פיגמנטציה קלה שעיר, אשר יש זיפים האחורי (a3), אבל לא anteriorly (a2). שינוי בפיגמנטציה בין זבובים הוא ציין הן את עוצמת הפיגמנטציה ואת רוחב של פיגמנט הלהקה. באופן כללי, וריאציה היא הגדולה ביותר במגזרים האחורי ביותר (קטעים הבטן 5, 6, ו -7) והוא נמוך יותר קטעים הקדמי יותר (הבטן se3 ו -4). יתר על כן, יש דימורפיזם מיני ב d melanogaster פיגמנטציה, עם זכרים בדרך כלל יש פיגמנטציה מלאה 5 ו tergites הבטן ( איור 4 ג ).

במרבית המחקרים של פיגמנטציה בטנית ב- d melanogaster , הפיגמנטציה טופלה כמאפיין קטגורי או סודי, כאשר הדפוס נמדד איכותית 27 , 28 , 29 או חצי כמותי בסולם 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . שיטות אלה סובלות בהכרח מחוסר דיוק, ומכיוון שהן מסתמכות על הערכה סובייקטיבית של פיגמנטציה, קשה להשוות את הנתונים בין המחקרים. מחברים אחדים כימו את הממדים המרחביים של פיגמנטציה 38 , 39 , את עוצמת הפיגמנטציה של סוג מסוים של קוטיקולה 23 , 25 , 39 , 40 , או את העוצמה הממוצעת של פיגמנטציה על פני הטרגיט הבטן כ -41 , 42 , 43 . אף על פי כן, שיטות כימות אלה אינן מודדות הן את האינטנסיביות והן את ההתפלגות המרחבית של הפיגמנטציה הבבטית בו זמנית, ולכן אינם לוכדים את הניואנסים של האופן שבו הפיגמנטציה משתנה על פני הבטןטחון. יתר על כן, כמה שיטות כימות אלה 38 , 41 , 42 , 43 דורשים את הנתיחה ואת הרכבה של cuticle הבטן. זה גם זמן רב הורס את המדגם, מה שהופך אותו זמין עבור ניתוחים מורפולוגיים נוספים. ככל שהבנת ההתפתחות והאבולוציה של הפיגמנטציה הבטן מעמיקה, כלים מתוחכמים יותר כדי למדוד במהירות ובדייקנות הן את ההתפלגות המרחבית והן את עוצמת הפיגמנטציה.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנצל את ניתוח התמונה הדיגיטלית כדי להשיג מדידה חוזרת ומדויקת יותר של פיגמנטציה הבטן ד melanogaster . המתודולוגיה כוללת שלושה שלבים. ראשית, הזבוב הבוגר הוא רכוב ללא הרס, ואת התמונה הדיגיטלית של הבטן הגב נלקח. שנית, באמצעות מאקרו ImageJ, המשתמשמגדיר פס קדמי קדמי של פיקסלים המשתרע הקדמי של a2 לציפורן האחורי של a5 cuticle (קופסה ירוקה, איור 1G ) על שני קטעים הבטן השלישי והרביעי. ערך הפיקסל הממוצע לאורך רוחב הרצועה מחולק לאורך ציר הזמן, ומייצר פרופיל המבחין בחלוקה המרחבית ובעוצמת הפיגמנטציה כפי שהיא משתנה מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הטרגיט. שלישית, סקריפט R משמש לתיאור פרופיל הפיגמנטציה במתמטיקה באמצעות קו מעוקב. התסריט R משתמש בשפכים ובנגזרות הראשון והשני שלו כדי לחלץ את רוחב הציפורן a2-a5, את רוחב רצועת הפיגמנט ואת רמות הפיגמנט המקסימליות והמינימליות. השיטה ולכן מכמת הן את המאפיינים המרחביים ואת עומק הפיגמנטציה בטן.

מתודולוגיה זו מכמתת את הפיגמנטציה של הטרגיטים הבטן השלישית והרביעית,אשר היו מוקד של מחקרים קודמים רבים 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , או באופן בלעדי או בשילוב עם tergites האחורי. אם כי פחות משתנה מאשר טרגיטים הבטן החמישית והשישית, tergites השלישי והרביעי אינם פיגמנטציה לחלוטין אצל גברים, כך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על גברים ונשים כאחד. עם זאת, כפי שמוצג כאן, פרוטוקול ניתן להשתמש כדי למדוד פיגמנטציה של 5 ו tergites הבטן הנקבות אצל נקבות. יתר על כן, שינויים קלים של סקריפטים המשמשים כדי לחלץ את המאפיינים של פרופיל פיגמנטציה צריך לאפשר את השיטה לשמש לכמת וריאציה פיגמנטציה במגוון רחב של אחריםאורגניזמים.

Protocol

1. הדגימה הרכבה הערה: חנות זבובים מתים באתנול 70% במים לפני הדמיה. יוצקים 10 מ"ל של אגר 1.25% מומס במים רותחים ב 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי ולאפשר לו להגדיר. ?…

Representative Results

הפרוטוקול שימש כדי לחקור את ההשפעה של טמפרטורת גידול על פיגמנטציה בטנית. מחקרים קודמים הראו כי עלייה בטמפרטורה התפתחותית גורמת לירידה בהתפשטות הפיגמנטציה הבטן במספר מינים של תסיסנית , כולל ד מלנוגאסטר 30 , 32…

Discussion

מתודולוגיה זו מאפשרת את הרכישה המדויקת, המהירה והדירנטית של נתוני הפיגמנטציה בצורה כמותית המתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם. השיטה שימשה כדי לרכוש נתונים על השפעת הטמפרטורה על פיגמנטציה בטן בקו איזוגני של זבובים. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה במחקרים עתידיים על גנ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים IOS-1256565 ו- IOS-1557638 ל- AWS. אנו מודים לפטרישיה ויטקופ ולשלושה מבקרים אנונימיים על הערותיהם המועילות על גרסה קודמת של מאמר זה.

Materials

Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. 유전학. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature’s tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. 유전학. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O’Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. 유전학. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. 유전학. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. . ImageJ v.1.50i Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016)
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2016)
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

Keywords: Abdominal PigmentationDrosophila MelanogasterEvolutionary BiologyMorphological PhenotypesNon-destructive MeasurementPigmentation PatternsInsectsAnimal TaxaMounting PadAgar GelMicroscope ImagingDigital CameraImage Analysis SoftwareGrayscaleLight SourceStage MicrometerScale Calibration
check_url/kr/55732?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image