पेट में रंजकता को बढ़ाते हुए<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
यह काम डिजिटल छवि विश्लेषण का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर की पेट की रंजकता को जल्दी और सटीक रूप से मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि में फेनोटाइप अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के बीच प्रक्रियाएं सुव्यवस्थित होती हैं और नमूना बढ़ते हुए, छवि अधिग्रहण, पिक्सेल मूल्य निष्कर्षण, और गुण माप शामिल हैं।
Abstract
रंजकता एक morphologically सरल लेकिन उच्च चर विशेषता है जो अक्सर अनुकूली महत्व है यह morphological phenotypes के विकास और विकास को समझने के लिए एक मॉडल के रूप में बड़े पैमाने पर सेवा की है। ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में पेट की रंजकता विशेष रूप से उपयोगी रही है, शोधकर्ताओं को स्थानीय की पहचान करने की अनुमति दी गई है जो आकृति विज्ञान में अंतः- और अंतःस्थापित विविधताएं शामिल हैं। अब तक, हालांकि, डी। मेलानोगस्टर पेट में रंजकता को काफी हद तक मात्रात्मक रूप से स्कोरिंग के माध्यम से गुणात्मक रूप से परख लिया गया है, जो सांख्यिकीय विश्लेषण के रूपों को सीमित करता है जो कि pigmentation डेटा पर लागू किया जा सकता है। यह काम एक नई पद्धति का वर्णन करता है जो वयस्क डी। मेलेनोगास्टर के पेट की रंजकता पैटर्न के विभिन्न पहलुओं की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल में नमूना बढ़ते, छवि कैप्चर, डेटा निष्कर्षण, और विश्लेषण शामिल हैं। छवि कैप्चर और विश्लेषण सुविधा मैक्रोज़ के लिए उपयोग किए गए सभी सॉफ्टवेयरखुले स्रोत छवि विश्लेषण के लिए लिखा इस दृष्टिकोण का लाभ विभिन्न इमेजिंग प्रणालियों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने वाली एक पद्धति का उपयोग करके वर्णक गुणों को ठीक करने की क्षमता है। जबकि प्रौढ़ डी। मेलेनोगस्टर के टीर्जल रंजकता पैटर्न में विविधता को मापने के लिए तकनीक का उपयोग किया गया है, इस पद्धति में लचीला है और असंख्य जीवों में वर्णक पैटर्न पर मोटे तौर पर लागू होता है।
Introduction
रंजकता प्रजातियों, आबादी, और व्यक्तियों के बीच, और यहां तक कि 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 के दौरान व्यक्तियों के बीच बहुत अधिक प्रोनोटीपिक विविधता दिखाती है। यद्यपि विभिन्न प्रकार के जानवरों में रंजकता के असंख्य अध्ययन हैं, ड्रगोफिला मेलेनोगास्टर में वर्णक का सबसे अच्छा अध्ययन किया गया है, जहां परमाणु आनुवांशिकी की पूरी शक्ति का उपयोग विकासशील और शारीरिक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया गया है, जो कि रंजकता को विनियमित करते हैं और ये तंत्र कैसे विकसित होते हैं 1 , 6 डी। मेलेनोगस्टर 7 , 8 में जीवाणुओं के जैव रासायनिक संश्लेषण को विनियमित करने वाली जीन के बारे में बहुत कुछ पता चला है और जीन जो अस्थायी और स्थानिक डायल को नियंत्रित करते हैंइस जैवसंश्लेषण 9 , 10 , 11 , 12 , 13 का वितरण इसके अलावा, आनुवांशिक मानचित्रण ने डी। मेलेनोगास्टर 14 , 15 , 16 , 17 में पेग्मेंटेशन में अंतर्निहित अंतर्-अंतर्निहित आनुवंशिक स्थान को पहचान लिया है। रंजकता और प्लीमेन्ट्रोपिक गुण, जैसे व्यवहार 18 , 1 9 और प्रतिरक्षा 1 9 , 20 , के बीच रिश्तों का पता लगाया गया है, जैसा कि रंजकता पैटर्न 15 , 21 , 22 के अनुकूली महत्व है। जैसे, डी। मेलेनोगास्टर में रंजकता एक शक्तिशाली अभी तक सरल मी के रूप में उभरी हैजटिल फेनोटाइप के विकास और विकास के लिए ओड
वयस्क डी। मेलेनोगास्टर में रंजकता, पूरे शरीर में विशेष रूप से पंखों और पृष्ठीय छाती और पेट पर मेलेनाइजेशन के विशिष्ट पैटर्न की विशेषता है। यह पृष्ठीय पेट पर प्रत्येक कटरिकली प्लेट (ट्रिगाइट) के रंगद्रव्य है, हालांकि, जिसने सबसे अधिक शोध ध्यान प्राप्त किया है। आनुवंशिक 17 , 23 और पर्यावरण 24 , 25 कारक दोनों के कारण, इस रंगद्रव्य ( चित्रा 1 ए- एफ ) में काफी भिन्नता है। पेट के ट्रिगाइट की छल्ली को पूर्वकाल और पीछे के विकास वाले डिब्बों ( चित्रा 1 जी ) से बना होता है, जिनमें से प्रत्येक को पगमेंटेशन और अलंकरण 26 के आधार पर आगे विभाजित किया जा सकता है। पूर्वकाल डिब्बे में छह छल्ली शामिल हैंप्रकार (ए 1-ए 6), और पीछे के डिब्बे में तीन (पी 1-पी 3) ( चित्रा 1 जी ) शामिल हैं। इनमें से, पी 1, पी 2, और ए 1 छल्ली आमतौर पर गैर-फैला पेट में ट्रिगेट के नीचे जोड़ दी जाती है ताकि वे छिपे रहें। भरोसेमंद रूप से दिखाई देने वाली छल्ली को भारी रंजकता के एक बैंड द्वारा चिह्नित किया जाता है, जिसे यहां "वर्णक बैंड" के रूप में संदर्भित किया जाता है, जिसमें छल्ली प्रकार ए 4 (मध्यम बाष्प के साथ बालों वाली) और ए 5 (बड़े बालों वाला बालों वाला), बैंड के पीछे की ओर पूर्वकाल किनारे ( चित्रा 1 जी ) की तुलना में अधिक तीव्रता से वर्णित। इस बैंड के पूर्वकाल में हल्के वर्णित बालों वाली छल्ली का क्षेत्र होता है, जो बाद में (ए 3) बरसता है, लेकिन पूर्वकाल में नहीं (ए 2)। मक्खियों के बीच रंगद्रव्य में बदलाव वर्णक की तीव्रता और वर्णक बैंड की चौड़ाई में दोनों में मनाया जाता है। सामान्य तौर पर, सबसे अधिक पश्चानुक्रमिक खंड (पेट के सेगमेंट 5, 6, और 7) में अंतर सबसे अधिक है और अधिक पूर्वकाल सेगमेंट में कम है (उदर सेGments 3 और 4) 24 इसके अलावा, डी। मेलेनोगास्टर पगमेन्टेशन में एक लैंगिक दिमाख़वाद होता है, आम तौर पर पुरुषों के पांचवें और छठे पेट वाले ट्रिग्रेट्स ( चित्रा 4 सी ) के रूप में वर्णित होते हैं।
डी। मेलेनोगास्टर में पेट में रंजकता के अधिकांश अध्ययनों में, वर्णक को एक स्पष्ट या अनुक्रमिक विशेषता के रूप में माना गया है, साथ ही पैटर्न 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 के पैमाने पर 27 , 28 , 29 या अर्द्ध मात्रात्मक रूप से मापा गया है। , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 ये विधियां अनिवार्य रूप से परिशुद्धता की कमी से पीड़ित हैं, और क्योंकि वे pigmentation के व्यक्तिपरक मूल्यांकन पर भरोसा करते हैं, सभी अध्ययनों में डेटा की तुलना करना मुश्किल है। कई लेखकों ने रंजकता 38 , 3 9 के स्थानिक आयामों को एक विशिष्ट छल्ली प्रकार 23 , 25 , 39 , 40 या पूरे पेटी ट्रिगाइट के पूरे 41 , 42 , 43 के रूप में रंगद्रव्य की औसत तीव्रता की तीव्रता को बढ़ाया है। इसके बावजूद, ये मात्रा का ठहराव विधियां एक तरफ पेट की रंजकता के तीव्रता और स्थानिक वितरण दोनों को मापने नहीं देती है और इसलिए इस बात की बारीकियों पर कब्जा नहीं है कि कैसे abdomen में pigmentation भिन्न होता हैओमिनल ट्रिग्रेट इसके अलावा, 38 , 41 , 42 , 43 में इन मात्रात्मक विधियों में से कई को पेट की छल्ली के विच्छेदन और बढ़ते जाने की आवश्यकता होती है। यह दोनों समय लगता है और नमूना को नष्ट कर देता है, जिससे यह अतिरिक्त रूपात्मक विश्लेषणों के लिए अनुपलब्ध हो जाता है। पेट के रंगद्रव्य के विकास और विकास की समझ के रूप में, अधिक परिष्कृत औजार जल्दी और सटीक दोनों को स्थानिक वितरण और रंगद्रव्य की तीव्रता को मापने की आवश्यकता होगी।
डी मेलेनोगास्टर में पेट की रंजकता के एक प्रतिकृति और अधिक सटीक उपाय प्राप्त करने के लिए इस पद्धति का समग्र लक्ष्य डिजिटल छवि विश्लेषण का उपयोग करना है । कार्यप्रणाली में तीन चरणों शामिल हैं सबसे पहले, वयस्क उड़ान गैर विनाशकारी रूप से घुड़सवार होती है, और पृष्ठीय पेट की एक डिजिटल छवि ली जाती है। दूसरा, एक ImageJ मैक्रो, उपयोगकर्ता का उपयोग करपिक्सेल की एक पूर्वकाल-पीछे वाली पट्टी को परिभाषित करता है जो कि ए 2 छल्ली के पूर्वकाल से तीसरी और चौथे पेट के दोनों हिस्सों पर ए 5 छल्ली (हरे रंग का बॉक्स, चित्रा 1 जी ) के पीछे के ऊपर फैली हुई है। इस पट्टी की चौड़ाई के ऊपर औसत पिक्सेल मूल्य उसके लंबे अक्ष के साथ निकाला जाता है, एक प्रोफ़ाइल तैयार करता है जो स्थानिक वितरण और रंगद्रव्य की तीव्रता को प्राप्त करता है क्योंकि यह पूर्वकाल से टरगाइट के पीछे के स्थान पर परिवर्तित होता है। तीसरा, एक आर स्क्रिप्ट का उपयोग ग्यारहवीं पट्टी का उपयोग करके गणितीय रूप से वर्णक चित्र को वर्णित करने के लिए किया जाता है। आर स्क्रिप्ट फिर ए 2-ए 5 छल्ली की चौड़ाई, वर्णक बैंड की चौड़ाई, और रंजकता के अधिकतम और न्यूनतम स्तर को निकालने के लिए स्पलाइन और उसके पहले और दूसरे व्युत्पन्न का उपयोग करता है। इसलिए विधि दोनों स्थानिक विशेषताओं और पेट में रंजकता की गहराई को बढ़ाती है।
इस पद्धति में तीसरे और चौथे पेट के tergites के pigmentation quantifies,जो 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 3 9 , 42 के कई पिछला अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया गया है, या तो अधिकतर पश्चवर्ती टरगेट्स के साथ या संयोजन में है। यद्यपि पांचवें और छठे पेट के टरगेट्स की तुलना में कम परिवर्तनीय, तीसरे और चौथे टरगेट पूरी तरह से नर में वर्णित नहीं हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल दोनों पुरुषों और महिलाओं के लिए लागू किया जा सकता है। फिर भी, जैसा कि यहां दिखाया गया है, प्रोटोकॉल का उपयोग महिलाओं में पांचवें और छठे पेट के ट्रिगिट में वर्णक को मापने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रंजकता प्रोफाइल की विशेषताओं को निकालने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली लिपियों में मामूली संशोधनों के लिए विधि को अन्य प्रकार की विविधता में रंगद्रव्य में भिन्नता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएजीवों।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पद्धति कई डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त मात्रात्मक रूप में वर्णक डेटा के सटीक, तेज़ और पुनरावर्तनीय अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। मक्खियों की एक isogenic लाइन में उदर pigmentation पर तापमान के प्रभाव पर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा IOS-1256565 और IOS-1557638 को ऐडवर्ड्स से वित्त पोषित किया गया था। हम पेट्रीसिया विटकोप और तीन अनाम समीक्षकों को इस पत्र के पहले संस्करण पर उनकी सहायक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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