Quantificazione della pigmentazione addominale in<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l'analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l'acquisizione di fenotipi e l'analisi dei dati e include il montaggio del campione, l'acquisizione di immagini, l'estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.
Abstract
La pigmentazione è un tratto morfologicamente semplice ma altamente variabile che spesso ha un significato adattativo. Ha servito ampiamente come modello per comprendere lo sviluppo e l'evoluzione dei fenotipi morfologici. La pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster è stata particolarmente utile, consentendo ai ricercatori di identificare i loci che sono alla base delle variazioni inter- e intraspecifiche della morfologia. Fino ad oggi, tuttavia, la pigmentazione addominale D. melanogaster è stata ampiamente analizzata qualitativamente, attraverso un punteggio piuttosto che quantitativo, che limita le forme di analisi statistica che possono essere applicate ai dati di pigmentazione. Questo lavoro descrive una nuova metodologia che consente la quantificazione di vari aspetti del pattern di pigmentazione addominale di D. melanogaster adulte . Il protocollo include il montaggio del campione, la cattura delle immagini, l'estrazione dei dati e l'analisi. Tutto il software utilizzato per le macro delle funzioni di acquisizione e analisi delle immaginiScritta per l'analisi delle immagini open source. Il vantaggio di questo approccio è la capacità di misurare con precisione i tratti di pigmentazione utilizzando una metodologia altamente riproducibile in diversi sistemi di imaging. Mentre la tecnica è stata utilizzata per misurare la variazione nei modelli di pigmentazione della terna di D. melanogaster adulte , la metodologia è flessibile e si applica generalmente ai modelli di pigmentazione in innumerevoli organismi diversi.
Introduction
La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all'interno di individui durante l'ontogenesi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un'ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono 1 , 6 . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster 7 , 8 ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento 18 , 19 e l'immunità 19 , 20 , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione 15 , 21 , 22 . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l'evoluzione di fenotipi complessi.
La pigmentazione nell'adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull'addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull'addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C'è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici 17 , 23 che quelli ambientali 24 , 25 fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell'ornamento 26 . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una "banda di pigmento", composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell'intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) 24 . Inoltre, c'è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ).
Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato 27 , 28 , 29 o semi-quantitativamente su scala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione 38 , 39 , l'intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola 23 , 25 , 39 , 40 , o l'intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l'intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione 38 , 41 , 42 , 43 richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell'evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l'intensità della pigmentazione.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l'analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un'immagine digitale dell'addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l'utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall'anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l'intensità della pigmentazione in quanto cambia dall'anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale.
Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un'ampia varietà di altreorganismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa metodologia consente l'acquisizione precisa, rapida e ripetibile di dati di pigmentazione in una forma quantitativa adatta a più analisi a valle. Il metodo è stato utilizzato per acquisire dati sull'effetto della temperatura sulla pigmentazione addominale in una linea isogenica di mosche. Tuttavia, la metodologia potrebbe essere utilizzata negli studi di avanzamento genetico per identificare i geni che stanno alla base delle differenze di pigmentazione tra individui, popolazioni o specie o studi reverse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation per IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Ringraziamo Patricia Wittkopp e tre anonimi recensori per i loro commenti utili su una versione precedente di questo articolo.
Materials
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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