Kvantifiserende abdominal pigmentering i<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Dette arbeidet presenterer en metode for raskt og nøyaktig kvantifisering av abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster ved hjelp av digital bildeanalyse . Denne metoden strømlinjeformer prosedyrene mellom fenotypeinnsamling og dataanalyse og inkluderer prøvemontering, bildeoppkjøp, pikselverdigekstraksjon og egenskapsmåling.

Abstract

Pigmentering er et morfologisk enkelt, men svært variabelt trekk som ofte har adaptiv betydning. Det har tjent mye som en modell for å forstå utviklingen og utviklingen av morfologiske fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har vært spesielt nyttig, slik at forskere kan identifisere loci som ligger til grund for inter- og intraspesifikke variasjoner i morfologi. Hittil har D. melanogaster abdominal pigmentering imidlertid i stor grad blitt analysert kvalitativt, gjennom scoring, snarere enn kvantitativt, som begrenser former for statistisk analyse som kan brukes på pigmenteringsdata. Dette arbeidet beskriver en ny metodikk som muliggjør kvantifisering av ulike aspekter av abdominalpigmenteringsmønsteret for voksen D. melanogaster . Protokollen inkluderer prøvemontering, bildeopptak, datautvinning og analyse. All programvare som brukes til makroer for bildeopptak og analysefunksjonerSkrevet for åpen kildekode bildeanalyse. Fordelen med denne tilnærmingen er evnen til å måle pigmenteringstrekkene nøyaktig ved hjelp av en metodikk som er svært reproduserbar på tvers av forskjellige bildesystemer. Mens teknikken har blitt brukt til å måle variasjon i tergalpigmenteringsmønstrene av voksen D. melanogaster , er metoden fleksibel og bredt anvendelig for pigmenteringsmønstre i utallige forskjellige organismer.

Introduction

Pigmentering viser enorm fenotypisk variasjon mellom arter, populasjoner og individer, og til og med innen enkeltpersoner under ontogeni ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Selv om det finnes myriade studier av pigmentering i et stort utvalg av dyr, har pigmentering kanskje best studert i Drosophila melanogaster , hvor full molekylær genetikk har blitt brukt til å belyse utviklings- og fysiologiske mekanismer som regulerer pigmentering og hvordan disse mekanismer utvikler seg ^{1 , 6} . Mye er kjent om gener som regulerer den biokjemiske syntese av pigmenter i D. melanogaster ^{7 , 8} og generene som styrer den tidsmessige og romlige diFordeling av denne biosyntesen ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Videre har genetisk kartlegging identifisert de genetiske lokaliteter som ligger til grunn for intra- og interspesifikke forskjeller i pigmentering i D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} . Forholdene mellom pigmentering og pleiotropiske egenskaper, som for eksempel oppførsel ^{18 , 19} og immunitet ^{19 , 20} , har også blitt utforsket, som har den adaptive betydningen av pigmenteringsmønstre ^{15 , 21 , 22} . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster dukket opp som en kraftig, men likevel enkel mOdel for utvikling og utvikling av komplekse fenotyper.

Pigmentering i voksen D. melanogaster er preget av tydelige mønstre av melanisering over hele kroppen, spesielt på vingene og dorsalt thorax og underliv. Det er pigmenteringen av hver kutikulær plate (tergitt) på dorsal underliv, men som har fått mest forskningsoppmerksomhet. Det er betydelig variasjon i denne pigmenteringen ( Figur 1A- F ), på grunn av både genetiske ^{17 , 23} og miljø ^{24 , 25} faktorer. Kutikulaen i en bukertergitt består av fremre og bakre utviklingsrom ( figur 1G ), som hver kan videreoppdeles, avhengig av pigmentering og utsmykning ²⁶ . Den fremre delen inneholder seks krysningerTyper (a1-a6), og det bakre rommet inneholder tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av disse foldes p1-, p2- og a1-kutikkene typisk under tergitten i ustrakte buk, slik at de er skjulte. Den pålitelige synlige kutikulaen er preget av et bånd av tung pigmentering, her referert til som et "pigmentbånd", bestående av kutikeltyper a4 (hårete med moderate børster) og a5 (hårete med store børster), med båndets bakre kant Mer intenst pigmentert enn den fremre kanten ( figur 1G ). Foran for dette bandet er en region med lettpigmentert hårete kutikula, som har børstene posteriorly (a3), men ikke anteriorly (a2). Variasjon i pigmentering mellom fluer observeres i både intensiteten av pigmentering og i bredden av pigmentbåndet. Generelt er variasjon størst i de mest bakre segmentene (magesegmentene 5, 6 og 7) og er lavere i de mer fremre segmentene (magesekkenGruppe 3 og 4) ²⁴ . Videre er det en seksuell dimorfisme i D. melanogaster- pigmentering, med hanner som generelt har fullpigmentert femte og sjette buk-tergitt ( figur 4C ).

I de fleste studier av abdominalpigmentering i D. melanogaster har pigmentering blitt behandlet som et kategorisk eller ordinært trekk, med mønsteret målt kvalitativt ^{27 , 28 , 29} eller halvkvantitativt på en skala ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35}, ^{36 , 37} . Disse metodene har uunngåelig lider av mangel på presisjon, og fordi de er avhengige av den subjektive vurderingen av pigmentering, er det vanskelig å sammenligne dataene på tvers av studier. Flere forfattere har kvantifisert de romlige dimensjonene av pigmentering ^{38 , 39} , intensiteten av pigmentering av en bestemt kutikeltype ^{23 , 25 , 39 , 40} eller den gjennomsnittlige intensiteten av pigmentering over buk-tergitten som helhet ^{41 , 42 , 43} . Ikke desto mindre måler disse kvantifiseringsmetodene ikke både intensiteten og den romlige fordeling av abdominal pigmentering samtidig, og derfor fanger ikke nyansene av hvordan pigmenteringen varierer over abdOminal tergitt. Videre krever flere av disse kvantifiseringsmetodene ^{38 , 41 , 42 , 43} disseksjonen og montering av bukekjøttet. Dette er både tidkrevende og ødelegger prøven, noe som gjør den utilgjengelig for ytterligere morfologiske analyser. Etter hvert som forståelsen av utviklingen og utviklingen av abdominalpigmentering øker, vil mer avanserte verktøy for å raskt og nøyaktig måle både romlig fordeling og intensitet av pigmentering kreves.

Det overordnede målet med denne metoden er å benytte digital bildeanalyse for å oppnå et replikerbart og mer presist mål for abdominalpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden inkluderer tre faser. Først er voksenflyget ikke-destruktivt montert, og et digitalt bilde av dorsal underlivet er tatt. For det andre, bruker en ImageJ makro, brukerenDefinerer en anterior-posterior stripe av piksler som strekker seg fra fremsiden av a2-kutikken til baksiden av a5-kutikulaen (grønn boks, figur 1G ) på både det tredje og det fjerde abdominalsegmentet. Den gjennomsnittlige pikselverdien over bredden av denne stripen blir deretter ekstrahert langs sin langsakse, og genererer en profil som fanger den romlige fordeling og intensiteten av pigmentering når den endres fra den fremre til den bakre delen av tergitten. For det tredje brukes et R-skript for å beskrive pigmenteringsprofilen matematisk ved hjelp av en kubisk spline. R-skriptet bruker deretter spline og dets første og andre derivat for å trekke ut bredden på a2-a5-kutikkelen, bredden av pigmentbåndet, og maksimale og minste nivåer av pigmentering. Metoden kvantifiserer derfor både romlige egenskaper og dybden av abdominal pigmentering.

Denne metoden kvantifiserer pigmenteringen av den tredje og fjerde abdominal tergitt,Som har vært i fokus i mange tidligere studier ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , enten utelukkende eller i kombinasjon med mer bakre tergitter. Selv om den er mindre variabel enn den femte og sjette buk-tergittene, er den tredje og fjerde tergitt ikke fullstendig pigmentert hos menn, så denne protokollen kan brukes til både menn og kvinner. Likevel, som vist her, kan protokollen brukes til å måle pigmentering i femte og sjette buk tergitt hos kvinner. Videre bør mindre modifikasjoner av skriptene som brukes til å trekke ut pigmenteringsprofilens karakteristikker, tillate at metoden brukes til å kvantifisere variasjonen i pigmentering i et bredt spekter av andreorganismer.

Protocol

1. Prøvemontering MERK: Oppbevar døde fluer i 70% etanol i vann før bildebehandling. Hell 10 ml 1,25% agar oppløst i kokende vann i en 60 mm x 15 mm petriskål og la den settes. Under et disseksjonsmikroskop skal du bruke et par fintpennpinner til å lage en ~ 20 mm, 2 mm bred, 1 mm dyp rille i overflaten av gelen. Ved hjelp av fine tang, legg inn den ventrale siden av en voksenfly i sporet, med den dorsale siden av flyet som rager over gelen. MERK: Gelens lø…

Representative Results

Protokollen ble brukt til å undersøke effekten av oppdrettstemperatur på abdominal pigmentering. Tidligere studier har vist at en økning i utviklingstemperaturen resulterer i en reduksjon av spredningen av abdominalpigmentering hos flere arter Drosophila , inkludert D. melanogaster 30 , 32 . Spesielt i dimma-tergittene 3 og 4 reduseres omfanget av pigmentering (bredden av pigmentbåndet) fra 17 ° C til 25 ?…

Discussion

Denne metoden tillater det presise, raske og repeterbare oppkjøpet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som er egnet for flere nedstrømsanalyser. Metoden har blitt brukt til å erverve data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen fluørlinje. Metoden kan imidlertid brukes i fremmedsgenetikkstudier for å identifisere gener som ligger til grunn for pigmenteringsforskjeller mellom individer, populasjoner eller arter, eller revers-genetiske studier for å undersøke effekten av bestemte gen…

Materials

Dumont #5 Biology Forceps	FST	11252-30
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Dissecting Scope	Leica	MZ16FA
Base	Leica	MDG41
Camera	Leica	DFC280
Gooseneck Cold Light Source	Schott	ACE 1
Image Acquisition Control Software	Micro-Manager v1.3.20		https://micro-manager.org/
Image Analysis Software	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software	R 3.3.2		https://www.r-project.org/
LED	Thor Labs	LEDWE-15
Multimeter	Fluke	Fluke 75 Series II
60 x 15 mm Petri dish	Celltreat Scientific Products	229663
Stage micrometer	Klarman Rulings, Inc.	KR-867