Aquí presentamos un método estereológico, el fraccionador óptico, utilizado para cuantificar la formación de nuevas neuronas, y su supervivencia, en el hipocampo de rata después de la estimulación electroconvulsiva. Cuando se implementa correctamente, la sensibilidad y eficiencia de los métodos estereológicos garantiza estimaciones precisas con una precisión fija y predeterminada.
Los métodos estereológicos están diseñados para describir parámetros cuantitativos sin hacer suposiciones sobre tamaño, forma, orientación y distribución de células o estructuras. Estos métodos han sido revolucionarios para el análisis cuantitativo del cerebro de mamífero, en el que las poblaciones de células volumétricas son demasiado altas para contar manualmente, y la estereología es ahora la técnica de elección cuando las estimaciones de las cantidades tridimensionales necesitan ser extraídas de las mediciones bidimensionales Secciones. Todos los métodos estereológicos son en principio imparciales; Sin embargo, se basan en el conocimiento apropiado sobre la estructura de interés y las características del tejido. La estereología se basa en un muestreo sistemático aleatorio (SURS) sistemático, con ajuste del muestreo al nivel más eficiente con respecto a la precisión, proporcionando información confiable y cuantitativa sobre toda la estructura de interés. Aquí presentamos el fraccionador óptico en conjunción con inmunohistoquímica BrdU tO estimar la producción y supervivencia de neuronas recién formadas en la capa de células granulares (incluida la zona sub-granular) del hipocampo de rata después de la estimulación electroconvulsiva, que está entre los estimuladores más potentes de la neurogénesis. La técnica de fraccionamiento óptico está diseñada para proporcionar estimaciones del número total de células de secciones gruesas muestreadas de la estructura completa. Las secciones gruesas proporcionan la oportunidad de observar las células en su extensión completa 3-D y por lo tanto, permiten una clasificación celular fácil y robusta basada en criterios morfológicos. Cuando se implementa correctamente, la sensibilidad y la eficiencia del fraccionador óptico proporcionan estimaciones precisas con una precisión fija y predeterminada.
La cuantificación de células en una estructura tridimensional (3-D) puede requerir la obtención de estimaciones basadas en principios imparciales. Incluso hoy en día, los estudios usan frecuentemente métodos bidimensionales (2-D) para reportar datos de estructuras tridimensionales. Sin embargo, estos métodos no consideran la naturaleza heterogénea de la estructura en términos de forma y distribución de células que resulta en limitaciones metódicas; Hacen suposiciones sobre la estructura tridimensional de interés y los resultados no se refieren a la estructura completa. Estas limitaciones reducen la sensibilidad y la precisión de los métodos, así como aumentan el riesgo de errores 1 .
El sesgo en el conteo de células puede evitarse mediante la aplicación de estereología basada en diseño, que es de importancia general para obtener información cuantitativa sobre el número de células en un tejido o estructura dado. Si bien la estereología ha sido un método que tarda mucho tiempo, los avances en procedimientos,Ware y la imagen, ha hecho que sea mucho más eficiente y ampliamente aplicable. La estereología implica principios de muestreo estadístico y teoría geométrica estocástica para proporcionar herramientas eficientes para estimar el volumen, el área superficial, la longitud y el número de objetos en una estructura tridimensional por muestreo en secciones 2D. Por lo tanto, la estereología permite obtener datos cuantitativos no sesgados sobre los cambios estructurales en las secciones de tejido, que dan estimaciones promedio de los números verdaderos, sin análisis exhaustivo 1 . La estereología se define como la inferencia estadística de los parámetros geométricos de la información muestreada. Esto puede lograrse mediante el muestreo no sesgado, es decir, el muestreo aleatorio sistemático de secciones, así como las reglas de conteo que aseguran que todos los objetos tienen probabilidades iguales de ser contados 3 . Mientras que los resultados estereológicos pueden tener diversos grados de precisión como se indica por el coeficiente de error (CE), esto puede serAjustada a la varianza biológica inherente (coeficiente de varianza (CV)) ajustando la cantidad de muestreo que se requiera 4 , 5 . Algunos estudios estereológicos previos han examinado los efectos a corto plazo de la estimulación electroconvulsiva (ECS) sobre la plasticidad del hipocampo en roedores 6,7 . Los datos de estos estudios muestran un aumento inicial en el número total de neuronas, así como una diferenciación sináptica elevada tras ECS repetidas. Sin embargo, estos estudios no estiman la neurogénesis directamente, ya que no utilizan marcadores específicos para la proliferación celular.
Aquí presentamos una aplicación de un método estereológico, la técnica de fraccionamiento óptico 8 , 9 , para cuantificar el número total de neuronas recién formadas en la capa celular de gránulos del hipocampo de rata (GCL), incluyendo también la zona subgranular (SGZ) Como su largo plazoUrvival 10 , 11 . Se sometió a las ratas a un calendario clínico relevante de ECS (tres veces a la semana durante 3 semanas), que es uno de los estimuladores más potentes de la neurogénesis [ 12] . Los animales de control se trataron usando el mismo procedimiento, pero sin pasar de corriente. En cada uno de los 21 días de experimentación, todas las ratas se inyectaron intraperitonealmente con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) que se incorpora en el ADN en lugar de timidina durante la división celular 13 . Después de la experimentación, las ratas se mantuvieron durante cuatro períodos de tiempo diferentes (24 horas, 3 meses, 6 meses y 12 meses). Utilizando el principio del fraccionador, se obtuvo una fracción conocida del hipocampo a través de un muestreo aleatorio uniforme de secciones, y se aplicaron los disectores ópticos (sondas 3-D) a las secciones de tejido grueso muestreado e inmunotenso. Se observa especialmente que las secciones congeladas generalmente se colapsan en el eje z durante el procesoY que los desvia- dores ópticos basados en el espesor de la sección media ponderada en número deberían usarse en este caso particular [ 14] . Como el plano focal de los disectores ópticos se movió una distancia conocida a través de la sección, las neuronas positivas para BrdU se contaron cuando su característica de interés se reconoce claramente. En el campo de la estereología hay cierto debate sobre el número total de partículas que deben contarse 15 ; Típicamente 150-200 neuronas se cuentan en la estructura de interés para obtener una precisión adecuada es decir un coeficiente de 7-8% 8 . Los conteos neuronales positivos para BrdU se completaron utilizando un software estereológico con formación de imágenes mediante un microscopio estándar equipado con cámara y los objetivos siguientes: 2X, 4X y 10X, así como un objetivo de inmersión en aceite 100X (abertura numérica = 1,40) y una etapa motorizada . Los movimientos en la dirección z se midieron con un microcador digital. La ampliación finalFue de 3000X.
Utilizando ECS como una metodología para inducir la neurogénesis, encontramos un aumento inmediato del 260% en la formación de nuevas neuronas positivas para BrdU en el hipocampo. En este conjunto de neuronas generadas de forma aguda encontramos 40% de desgaste desde el día 1 hasta tres meses, con casi el 50% de las neuronas recién formadas sobreviviendo al menos 12 meses después del tratamiento 10 , 11 . El recuento de las neuronas marcadas con BrdU siguió un estricto esquema de muestreo, con lo cual el hipocampo entero se cortó en secciones de 80 μm de espesor seguido de submuestreo de cada 5 ª sección con un inicio de muestreo aleatorio entre la sección uno y la sección cinco. Proporcionar estas secciones se eligen de manera sistemática al azar, esto es demostrablemente un excelente método para reducir la varianza del resultado final, sin recuento exhaustivo 1 . Este esquema de muestreo nos permitió contar neuronas positivas a BrdU en un promedio de 12 (8-16) hipocamposEn cada cerebro de rata, con una precisión final del 9-11%.
Cuando se utiliza el método del fraccionador, es esencial conocer la fracción de la altura de la sección en la que se realiza el recuento, ya que la contracción y deformación tisular ocurre frecuentemente durante el procesamiento histológico 14 . De hecho, se observó una contracción considerable del grosor en este estudio. Además, debe observarse que puede producirse una retracción diferencial del tejido, tal como se presenta en Dorph-Petersen et al. 2001. Sin embargo, siempre y cuando la estructura completa de interés esté disponible para el análisis, estas limitaciones no resultan en un sesgo del número total de partículas, es decir , las neuronas positivas para BrdU. En estudios en los que la contracción del tejido es un problema particular, siempre debe indicarse que los resultados se obtienen en tejido deformado. En este estudio, se contó con una altura de 10 μm. Las secciones del presente estudio tenían un espesor medio final de 26 μm, un espesor de 5 μmZona de protección en la parte superior y una zona de guarda de 11 μm (media) en la parte inferior de la sección. Estos parámetros son aceptables ya que las zonas de protección deben ser aproximadamente el diámetro de las partículas muestreadas.
Después de la delineación del GCL / SGZ, los disectors fueron colocados uniformemente aleatoriamente dentro del área delineada. Los descriptores deben ser posicionados con una longitud de paso fija que optimice el muestreo y el recuento para obtener eficientemente estimaciones con una precisión determinada por el investigador. La precisión óptima se logra típicamente contando hasta 150-200 células en cada estructura de interés 5 . En el presente estudio, se contó una media de 133 (rango 33-372) BrdU-positivas neuronas en cada rata hipocampo. Debido a un bajo número de células en algunos de los animales de control, nuestro número de neuronas positivas para BrdU cayó por debajo del número generalmente aceptable de células necesarias para obtener una precisión adecuada, lo que dio lugar a valores CE relativamente altos para esos casos. MARIDOSin embargo, como obtuvimos valores CE de menos de la mitad de los valores de CV (ver sección de resultados representativos) no se requirió muestreo y conteo adicionales. Los altos valores de CV muestran que el mayor contribuyente a la variación observada proviene de la variación biológica. De hecho, podríamos afirmar que el número promedio de neuronas positivas para BrdU contadas en el presente estudio fue mayor de lo necesario. Por ejemplo, en un grupo de ratas alcanzamos un valor de CE del 9% y observamos un valor de CV del 43%. En este caso particular, podríamos haber apuntado para una precisión de aproximadamente el 20%. En resumen, la precisión del número total de neuronas positivas para BrdU en el presente estudio es suficiente, ya que captura los efectos reales del tratamiento sobre el número real de partículas. Debido a la variación biológica bastante grande en ciertos grupos de animales, las mismas estimaciones se podrían haber obtenido con una precisión aceptable, a pesar de un menor gasto de esfuerzo. Las altas variaciones biológicas dentro de los gruposSer compensado aumentando el número de animales.
Se podría argumentar que el estándar de oro para obtener el número exacto de células implica el recuento exhaustivo de todos los objetos de interés. Sin embargo, en la mayoría de los estudios del cerebro esto no es una posibilidad debido al gran número de células. Aunque mucho más eficiente que el recuento exhaustivo de células, el fraccionador opcional es relativamente demorado en comparación con el simple cribado de diferencias en el número de células que se prefiere si el número exacto de células no es esencial. Es nuestra experiencia que las diferencias de más del 20-30% se pueden detectar puramente por procedimientos de selección.
Si se realiza correctamente, el muestreo utilizando estereología basada en diseño proporciona estimaciones imparciales y precisas de manera eficiente 1 . La propiedad imparcial de la estereología produce estimaciones que, cuando se replican, se aproximan a la media real de la población y mejoran la reproducibilidad de laEstimación 21 . Inicialmente, se debe obtener una muestra representativa de toda la estructura de interés (en este estudio, el hipocampo GCL / SGZ), permitiendo la estimación en un subconjunto estadísticamente válido de las secciones 4 . Para obtener un número apropiado de secciones y sondas de recuento aplicamos SURS, lo que reduce la varianza en comparación con el muestreo aleatorio 8 . Además, SURS asegura que las partículas de interés dentro de la estructura son muestreadas con las mismas probabilidades, independientemente de su tamaño, forma, orientación y distribución en la estructura. Como tal estereología es muy recomendable cuando la obtención de estimaciones precisas e imparciales es un aspecto central del proyecto.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Susanne Sørensen por la hábil asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Velux; La Fundación Jascha; Aase y la Fundación Ejnar Danielsens; Fundación Hermanos Hartmann; El director Jacob Madsen y la esposa Olga Madsens Foundation; El doctor Sofus Carl Emil Friis y la esposa Doris Friis 'Trust; La Fundación de 1870; Torben y la Fundación Alice Frimodts y la Fundación para la Investigación Neurológica. La edición de manuscritos fue realizada por Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |