DiI perfusjon som en metode for vaskulær visualisering i<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
Ved bruk av en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyanin-perklorat (DiI) -fargingsteknikk, kan Ambystoma-mexicanske gjennomgå vaskulær perfusjon for å muliggjøre enkel visualisering av vaskulaturen.
Abstract
Perfusjonsteknikker har blitt brukt i århundrer for å visualisere sirkulasjonen av vev. Axolotl (Ambystoma mexicanum) er en art av salamander som har oppstått som en viktig modell for regenereringsstudier. Det er lite kjent om hvordan revaskularisering skjer i sammenheng med regenerering i disse dyrene. Her rapporterer vi en enkel metode for visualisering av vaskulaturen i aksolotl via perfusjon av 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI). DiI er et lipofilt karbocyaninfargestoff som umiddelbart settes inn i plasmamembranen til endotelceller. Perfusjon gjøres ved bruk av en peristaltisk pumpe slik at DiI går inn i sirkulasjonen gjennom aorta. Under perfusjon flyter fargestoffet gjennom axolotls blodkar og inkorporerer i lipid-bilaget av vaskulære endotelceller ved kontakt. Perfusjonsprosedyren tar omtrent en time for en åtte-tommers aksolotl. Umiddelbart etter perfusjon wiDiI, kan axolotl visualiseres med et konfokal fluorescerende mikroskop. DiI utsender lys i det rød-oransje området når det er opphisset med et grønt fluorescerende filter. Denne DiI perfusjonsprosedyren kan brukes til å visualisere den vaskulære strukturen til aksolotler eller å demonstrere mønstre av revaskularisering i regenererende vev.
Introduction
Visualisering av vaskulatur spiller en viktig rolle i å forstå strukturen og funksjonen av organismer på tvers av mange arter. Fra det 16. århundre med Leonardo da Vinci, har modeller og grafiske representasjoner av sirkulasjonen blitt studert 1 . Ved hjelp av voks og gummiforme ble vev perfusjonert for å skape tredimensjonale modeller av vaskulaturen, som tillot studiet av organogenese og patogenese 1 , 2 . Harpikser og voks ble farget med fargestoffer som India Ink eller carmine rød for å tillate deres enkle visualisering 1 , 2 . Imidlertid forårsaket disse teknikkene mange problemer fordi deres høye viskositeter forhindret full perfusjon av vev av interesse 1 . Da feltet ble mer sofistikert, kom bruk av konfokale og elektronmikroskop inn i spill, og flyttet perfusjonsteknikken Ues vekk fra støpeformer og mot væskeformige perfusjoner av vaskulaturen, hvorav noen tillater perfusjon og avbildning av blodkar uten å ødelegge startvevet 3 . DiI, et fluorescerende karbocyaninfargestoff, er en slik flekk som tillater perfusjon av dyr uten skade på det vaskulære vevet.
Carbocyanin-fargestoffer er lipofile fargestoffer som innarbeider i cellemembraner ved kontakt. Disse fargene tillater enkel og øyeblikkelig farging av vaskulære endotelceller, som deretter kan ses under et fluorescerende konfokalmikroskop. DiI beveger seg via lateral diffusjon i lipidmembranen av celler, som vist i merking og sporing av nevroner 4 . Kjemisk gir de to alkylkjedene av DiI fargestoffet sin høye affinitet for cellemembraner, mens to konjugerte ringer fra en fluorokrom som er ansvarlig for å sende en rød bølgelengde når den blir opphisset av grønne fluorescerende lysfiltre> 4. DiI har blitt brukt i mange kapasiteter, inkludert vellykket merking av plasmamembranen og både anterograd og retrograd merking i nevroner 5 , 6 . DiI har tidligere vært brukt i perfusjonsprotokoller mens du visualiserer muskulaturen 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) er salamanders som bor utelukkende i brakiske innsjøer i nærheten av Mexico City, Mexico. Disse dyrene har blitt en viktig modell for å forstå regenerative prosesser som de kan regenerere hele lemmer, hale (inkludert nerve ledning), hjertepartier og andre indre organer og deler av øyet som voksne 8 , 9 . I tillegg, med den nylig anvendte genetiske verktøyet i aksolotene, er det nå mulig å få enestående innsikt i molekylene og cellene som driver disse prosessene 8 . Den vellykkede regenenRation av en hel lem krever en omfattende revaskulariseringsprosess, som kan spille en betydelig rolle i regenerering utover bare de tradisjonelle funksjonene til blodkar i å gi oksygen og næringsstoffer. Forståelse av revaskularisering i sammenheng med vevregenerering er viktig. Axolotl blodkar har tidligere blitt visualisert ved hjelp av India Ink, og mens resultatene var spennende, har denne prosessen ikke blitt revidert i påfølgende tiår 10 . Vi søkte å tilpasse en DiI perfusjonsprotokoll utviklet for bruk i pattedyr for å muliggjøre en fullstendig perfusjon og visualisering av aksolotlvaskulaturen 7 . Denne protokollen beskriver trinnene som er tatt for å perfeksjonere og senere visualisere aksolotl-sirkulasjonen med en DiI-fargingsteknikk. Denne prosedyren vil tillate nøyaktig visualisering av patent blodkar i hjemostatiske vev, så vel som i regenererende vev, og gir en ny metode for visualizatioN og analyse av revaskulariseringsprosessen i axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visualisering av aksolotlens vaskulat kan vellykkes gjennom perfusjon med det lipofile karbocyaninfargestoffet, DiI. I denne studien beskriver vi en romanprotokoll for perfusjon av axolotl med DiI ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Vi viser også den påfølgende visualiseringen av aksolotlvaskulaturen ved hjelp av et fluorescerende konfokalmikroskop. Denne protokollen var en tilpasning av gnagere DiI perfusjonsprotokollen sett i Li et al. 7 , men store forskjeller mellom gnageren og ax…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøkelsen ble støttet av Brigham & Women's Hospital og March of Dimes. Forfatterne vil gjerne takke alle medlemmene av Whited Lab for deres støtte og råd.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
