친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
관류 기술은 조직 순환을 시각화하기 위해 수세기 동안 사용되어 왔습니다. Axolotl (Ambystoma mexicanum)은 재생 연구에 필수적인 모델로 부상 한 도롱뇽 종입니다. 이러한 동물에서 재생의 맥락에서 혈관 재개 골이 어떻게 발생하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 여기에 우리는 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)의 관류를 통한 axolotl에서 vasculature의 시각화를위한 간단한 방법을보고합니다. DiI는 내피 세포의 원형질막에 순간적으로 삽입되는 친 유성 카보시 아닌 염료이다. 관류는 DiI가 대동맥을 통해 혈액 순환을 시작하도록 연동 펌프를 사용하여 이루어집니다. 관류 중에 염료는 axolotl의 혈관을 통해 흐르고 접촉시 혈관 내피 세포의 지질 이중층으로 통합됩니다. 관류 절차는 8 인치 axolotl에 대해 약 1 시간이 걸립니다. 관류 직후Axiotl은 공 촛점 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. DiI는 녹색 형광 필터로 여기 될 때 적색 주황색 범위에서 빛을 방출합니다. 이 DiI 관류 절차는 axolotls의 혈관 구조를 시각화하거나 재생 조직에서 revascularization의 패턴을 보여주는 데 사용할 수 있습니다.
서론
vasculature의 시각화는 많은 종의 생물체의 구조와 기능을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 레오나르도 다빈치 (Leonardo da Vinci)와 함께 16 세기를 시작으로 순환의 모델과 그래픽 표현이 연구되었습니다 1 . 왁스와 고무 몰드를 사용하여 조직을 관류하여 혈관 구조의 3 차원 모델을 만들어 기관 발생과 병인에 대한 연구를 허용했다. 수지 및 왁스는 인도 잉크 또는 카민 레드와 같은 염료로 착색되어 쉽게 시각화 할 수있었습니다 1 , 2 . 그러나,이 기술은 높은 점도가 관심있는 조직의 완전한 재관류를 방해했기 때문에 많은 문제를 야기했습니다. 분야가 더욱 정교 해짐에 따라 공 초점 및 전자 현미경을 사용하여 관류 기술을 이동 시켰습니다 주형에서 떨어져서 혈관계의 액체 관류로 이동하며, 그 중 일부는 초기 조직을 파괴하지 않고 혈관의 관류 및 영상화를 허용한다. 형광 색소 인 DiI는 혈관 조직에 손상을주지 않고 동물의 재관류를 허용하는 얼룩 중 하나입니다.
Carbocyanine 염료는 접촉시 세포막에 통합되는 친 유성 염료입니다. 이 염료는 혈관 내피 세포를 ....
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프로토콜
모든 axolotl 실험은 Brigham and Women 's Hospital (BWH) 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다.
1. 관류 실험 설정
- 0.1 % 트리 카인 용액 (MS222)으로 채워진 플라스틱 용기에 성인 axolotl을 15-20 분 동안 또는 완전히 마취 될 때까지 놓습니다. axolotl이 완전히 잠기도록 용기에 충분한 트리 카인 용액이 채워 졌는지 확인하십시오.
주 : 모든 절차는 기관 동물 관리 지침에 따라 수행되어야합니다. BWH에서 axolotl은 foot-pinch test에 실패 할 때 완전히 마비 된 것으로 간주됩니다. 즉, 발이 부드럽게 눌려 질 때 반사 운동이 없음을 의미합니다.
주의 : 트리 세인은 수생 생물에 특별히 사용되는 마취제이지만 트리 카인 용액과 직접 피부 접촉을 피하십시오. - axolotl 관류 스테이션을 설정하십시오.
- 장소흡수성 패드를 평평하고 평평한 표면에 놓고 흡수성면을 위로 향하게합니다.
- anesthetized axolotl가 앙와위 위치에 누워 적절한 크기와 모양입니다 폴리스티렌 폼 프레임에 구멍을 자르십시오. 프레임을 흡수 패드 ....
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결과
DiI 염색으로 Axolotl의 혈관계를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 친 유성 염료로 관류 된 동물의 혈관은 형광 공 촛점 현미경으로 즉시 볼 수 있습니다. 그림 1 .1-1.5 는 재관류 프로토콜의 개략도입니다. 밝은 핑크색 염료로 관류 한 후, 성공적으로 관류 된 축색 돌기가 분홍색으로 보일 것입니다. 공 촛점 현미경에 녹색 형광 필터를 사용하면 혈관 네트워크의 빨간색 방출이 나타납니다. DiI 염색은 꼬리, 사지, 아가미 및 눈 ( 그림 2A , 그림 2B , 그림 2C , 그림 2D , 각각)을 포함하여 관류가 성공적 일 때 모든 신체 조직에서 발생합니다........
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토론
axolotl의 vasculature의 시각화는 lipophilic 카보시 아닌 염료, DiI와 재관류를 통해 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 이 연구에서는 연축 펌프를 사용하여 DiI로 axolotl을 재관류하기위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 형광 공 촛점 현미경을 사용 axolotl vasculature의 후속 시각화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 Li et al. 에서 볼 수있는 설치류 DiI 재관류 프로토콜의 적응 이다. 7 , 그러나 설치류와 axolotl 사이의 주요 차이점은 axolotl 모델에 맞게 프로토콜의 개정이 필요했습니다.
이 연구는 혈관 구조를 성공적으로 시각화하기 위해 axolotl의 DiI 재관류 방법을 논의합니다. 도롱뇽과 설치류 사이의 해부학 및 생리학의 차이는 바늘 삽입 위치, 재관류 방법 및 사용 된 시약을 포함하여 관류의 주요 측면에서 변경을 요구합니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Brigham & Women 's Hospital과 March of Dimes에서 지원되었습니다. 저자는 Whited Lab의 모든 구성원의 지원과 조언에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 연동 펌프 | 마샬 사이언티픽 | RD-RP1 | |
| 관류 튜빙 | Excelon Lab & 진공 튜빙 | 436901705 | 크기 S1A |
| 27g 나비 바늘 | EXELint 의료 제품 | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| 증류수 | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| 포도당 | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- 테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트 | 시그마 알드리치 | 468495 | |
| 에탄올 (100% vol/vol) | 시그마 알드리치 | 64-17-5 | |
| 외과용 포셉스 | Medline | MDG0748741 | |
| 폴리스티렌 폼 | 아홀로틀 모양으로 어떤 폴리스티렌 폼 사각형이든 프레임 | ||
| 수술용 가위 | Medline | DYND04025 | |
| 메스 | Medline | MDS15210 | |
| 흡수성 언더패드 | Avacare Medical | PKUFSx | |
| 종이 타월 | |||
| 표준 일회용 이송 피펫 | Fisherbrand | 50216954 | |
| 클램프 스탠드 | Adafruit | 291 | |
| 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이 | 트 시그마 알드리치 | E10521 | 트리카인 |
| 분말 성인 axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| 플라스틱 탱크 | axolotl에 적합한 다양한 크기 | ||
| 파라포름알데히드 | 시그마 알드리치 | 30525-89-4 | |
| 아홀로틀 | |||
| 라이카 현미경 | 라이카 | M165 FC | |
| ET-CY3 형광 필터 | 라이카 | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
참고문헌
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.
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재인쇄 및 허가
