La perfusion DiI comme méthode de visualisation vasculaire dans<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
En utilisant une technique lipidique lipophile de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), Ambystoma mexicanum peut subir une perfusion vasculaire pour permettre une visualisation facile du système vasculaire.
Abstract
Les techniques de perfusion ont été utilisées depuis des siècles pour visualiser la circulation des tissus. Axolotl (Ambystoma mexicanum) est une espèce de salamandre qui est apparue comme un modèle essentiel pour les études de régénération. On sait peu de choses sur la façon dont la revascularisation se produit dans le contexte de la régénération chez ces animaux. Ici, nous rapportons une méthode simple pour la visualisation de la vascularisation dans l'axolotl par perfusion de perchlorate de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine (DiI). DiI est un colorant de carbocyanine lipophile qui s'insère instantanément dans la membrane plasmique des cellules endothéliales. La perfusion se fait à l'aide d'une pompe péristaltique telle que DiI entre dans la circulation à travers l'aorte. Pendant la perfusion, le colorant s'écoule à travers les vaisseaux sanguins de l'axolotl et incorpore dans la bicouche lipidique des cellules endothéliales vasculaires lors du contact. La procédure de perfusion prend environ une heure pour un axolotl de huit pouces. Immédiatement après la perfusion avecThiI, l'axolotl peut être visualisé avec un microscope fluorescent confocal. Le DiI émet de la lumière dans la gamme rouge-orange lorsqu'il est excité par un filtre fluorescent vert. Cette procédure de perfusion DiI peut être utilisée pour visualiser la structure vasculaire des axolotls ou pour démontrer des modèles de revascularisation dans les tissus régénérants.
Introduction
La visualisation de la vascularisation joue un rôle essentiel dans la compréhension de la structure et de la fonction des organismes dans de nombreuses espèces. À partir du 16 ème siècle avec Leonardo da Vinci, des modèles et des représentations graphiques de la circulation ont été étudiés 1 . En utilisant des cires et des moules en caoutchouc, les tissus ont été perfusés pour créer des modèles tridimensionnels de la vascularisation, ce qui a permis d'étudier l'organogenèse et la pathogenèse 1 , 2 . Les résines et les cires ont été colorées avec des colorants tels que l'encre Inde ou le rouge carmin pour permettre leur visualisation facile 1 , 2 . Cependant, ces techniques ont causé de nombreuses problèmes parce que leurs viscosités élevées ont empêché une perfusion complète du tissu d'intérêt 1 . Au fur et à mesure que le terrain devenait plus sophistiqué, l'utilisation de microscopes confocaux et électroniques entrainait, en déplaçant la technique de perfusion À l'écart des moules et aux perfusions liquides de la vascularisation, dont certains ont permis la perfusion et l'imagerie des vaisseaux sanguins sans détruire le tissu initial 3 . DiI, un colorant fluorescent de carbocyanine, est une telle tache qui permet la perfusion d'animaux sans endommager le tissu vasculaire.
Les colorants de carbocyanine sont des colorants lipophiles qui incorporent dans les membranes cellulaires lors du contact. Ces colorants permettent une coloration facile et instantanée des cellules endothéliales vasculaires, qui peuvent ensuite être visualisées sous un microscope confocal fluorescent. DiI se déplace par diffusion latérale dans la membrane lipidique des cellules, comme le montrent le marquage et le traçage des neurones 4 . Chimiquement, les deux chaînes alkyle de DiI donnent au colorant sa haute affinité pour les membranes cellulaires, tandis que deux anneaux conjugués d'un fluorochrome qui est responsable de l'émission d'une longueur d'onde rouge lorsqu'ils sont excités par des filtres fluorescents verts> 4. Le DII a été utilisé à bien des égards, y compris l'étiquetage réussi de la membrane plasmique et l'étiquetage antérogène et rétrograde dans les neurones 5 , 6 . DiI a déjà été utilisé dans les protocoles de perfusion lors de la visualisation du système vasculaire de souris 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sont des salamandres qui vivent exclusivement dans des lacs saumâtres près de Mexico, au Mexique. Ces animaux sont devenus un modèle important pour la compréhension des processus régénératifs car ils peuvent régénérer les membres complets, la queue (y compris le cordon nerveux), les parties du cœur et d'autres organes internes et des parties de l'œil en tant qu'addents 8 , 9 . En outre, avec la récente application d'outils génétiques dans les axolotls, un aperçu sans précédent des molécules et des cellules conduisant ces processus est maintenant possible 8 . Le regene réussieLa ration d'un membre entier nécessite un processus de revascularisation étendu, qui peut jouer un rôle important dans la régénération au-delà des fonctions traditionnelles des vaisseaux sanguins en fournissant de l'oxygène et des nutriments. La compréhension de la revascularisation dans le contexte de la régénération tissulaire est impérative. Les vaisseaux sanguins d'Axolotl ont déjà été visualisés en utilisant l'encre de l'Inde, et pendant que les résultats étaient intrigants, ce processus n'a pas été revisité au cours des décennies suivantes 10 . Nous avons cherché à adapter un protocole de perfusion DiI développé pour être utilisé chez les mammifères pour permettre une perfusion et une visualisation complète de la vascularisation axolotl 7 . Ce protocole décrit les étapes de perfusion et de visualisation ultérieure de la circulation axolotl avec une technique de coloration DiI. Cette procédure permettra une visualisation précise des vaisseaux sanguins brevetés dans les tissus homéostatiques, ainsi que dans la régénération des tissus, et fournit une nouvelle méthode de visualisationN et analyse du processus de revascularisation dans l'axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualisation du système vasculaire de l'axolotl peut être réalisée avec succès par perfusion avec le colorant carbocyanine lipophile, DiI. Dans cette étude, nous décrivons un nouveau protocole pour la perfusion de l'axolotl avec DiI à l'aide d'une pompe péristaltique. Nous montrons également la visualisation ultérieure de la vascularisation axolotl à l'aide d'un microscope confocal fluorescent. Ce protocole était une adaptation du protocole de perfusion DiI de rongeurs vu dans Li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le Brigham & Women's Hospital et March of Dimes. Les auteurs souhaitent remercier tous les membres du Whited Lab pour leur soutien et leurs conseils.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
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