Получение везикул плазматических мембран из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для потенциальной заместительной терапии цитоплазмы
Summary
Возрастные заболевания связаны с множественными дефектами в компонентах цитоплазмы. Здесь мы представляем протокол для подготовки везикул плазматической мембраны из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Этот метод потенциально может быть использован в качестве средства заместительной терапии цитоплазмы для улучшения или даже отмены возрастных фенотипов.
Abstract
Ранее мы сообщали о генерации везикул плазматической мембраны (ПМВ) посредством механической экструзии клеток млекопитающих. Слияние PMV с митохондриально дефицитными Rho0 клетками восстанавливало митотическую активность в нормальных условиях культивирования. Атеросклероз, диабет типа 2, болезнь Альцгеймера и рак – это связанные с возрастом заболевания, которые, как сообщается, связаны с множественными механическими и функциональными дефектами в цитозоле и органеллах различных типов клеток. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) представляют уникальную популяцию клеток из костного мозга, которые обладают способностями к самообновлению, сохраняя при этом свою мультипотентность. Дополнение клеток старения молодой цитоплазмой из аутологичных BMSC посредством слияния PMVs обеспечивает перспективный подход для улучшения или даже отмены обратных возрастных фенотипов. Этот протокол описывает, как готовить PMV из BMSC посредством экструзии через поликарбонатную мембрану с 31 мкм, определяют существование митохондрий и исследуют поддержание мембранного потенциала в пределах PMV с помощью конфокального микроскопа, концентрируют PMV центрифугированием и осуществляют in vivo инъекцию PMV в икроножную мышцу мышей.
Introduction
Огромные усилия были направлены на разработку подходов к терапии генной, ферментной и клеточной заместительной терапии. Это привело к большим прорывам и даже клиническим применениям 1 , 2 , 3 . В последнее время спорная митохондриальная заместительная терапия, основанная на технологии переноса ядра, была применена для экстракорпорального оплодотворения у женщин пожилого возраста или с летальной мутацией митохондриальной ДНК 4 . Дефекты, обнаруженные в возрастных заболеваниях, включая атеросклероз, диабет типа 2, болезнь Альцгеймера и рак, обычно многогранны. Было зарегистрировано, что накопление капель липидов; Отложение амилоидного белка; Сохранение нераскрытых белков в эндоплазматическом ретикулуме; И дефектная протеасома, аутофагосома и митохондрии способствуют развитию или обострению этих заболеваний"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . В настоящее время нет доступного механизма, направленного на непосредственное устранение неисправности в цитозоле и органеллах, что вызывает фенотипы старения и старения.
Ранее мы сообщали о генерации везикул плазматической мембраны (ПМВ) посредством механической экструзии клеток млекопитающих 12 . За исключением ядра, в PMV были обнаружены компоненты в мембране или цитозоле, включая белки и РНК, а также органеллы, такие как митохондрии. По существу, PMV можно рассматривать как миниатюрно-энуклеированную клетку. Более важно то, что слияние PMV с клетками Rho0, дефицитными по митохондриям, восстанавливало митотическую активность в нормальных условиях культивирования. Это первый отчет обПотенциально эффективный подход для заместительной терапии цитоплазмы.
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSC) являются мультипотентными клетками-предшественниками, которые обычно получают из костного мозга и легко расширяются в культуре. Маркеры эмбриональных стволовых клеток Oct4, Nanog и SOX2 были обнаружены на низких уровнях в MSC 13 . Активность теломеразы также поддается измерению. Кроме того, отсутствие ко-стимулирующих молекул и молекул человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса II, а также низкая экспрессия HLA класса I в MSCs делают их идеальными клетками для аллогенного или «готового к использованию» применения в Как регенеративной медицины, так и иммуномодулирующих применений 14 .
Здесь мы описываем, как готовить PMV из мышей BMSC через экструзию через поликарбонатную мембрану с порами 3 мкм, определять существование митохондрий и исследовать поддержание мембранного потенциала в PMV с помощью confocМикроскопии, получают концентрированные, но не агрегированные PMV центрифугированием, и осуществляют in vivo инъекцию PMV в икроножную мышцу мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Фондом Ли Ка Шин, Проектом Университета высокого уровня провинции Гуандун «Зеленые технологии для морских отраслей», Фондом естественных наук Китая (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) и Департамент образования провинции Гуандун (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
