Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em> In vitro</em> Kultivierte menschliche primäre Myotubes

Summary

Bei diesem Verfahren werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glucose-Aufnahmeraten werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ ³ H] 2-Desoxy-D-Glucose.

Abstract

Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Die Beurteilung der Insulinsensitivität von Muskelzellen ist für alle Studien, die der Erforschung des Muskelglukosestoffwechsels und der Charakterisierung von Stoffwechselveränderungen gewidmet sind, von großer Bedeutung. In den Muskelzellen bewegen sich Glukosetransporter Typ 4 (GLUT4) -Proteine ​​als Reaktion auf Insulin in die Plasmamembran, so dass ein massiver Eintritt von Glukose in die Zelle möglich ist. Die Fähigkeit der Muskelzellen, auf Insulin zu reagieren, indem sie die Rate der Glukoseaufnahme erhöht, ist eine der Standardauslesungen, um die Empfindlichkeit der Muskelzelle gegenüber Insulin zu quantifizieren. Menschliche primäre Myotubes sind ein geeignetes in vitro- Modell, da die Zellen viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich Insulinsensitivität. Dieses in vitro Modell eignet sich auch für den Test von Verbindungen, die die Insulinreaktion beeinflussen könnten. Messungen der Glukoseaufnahmerate in differenzierten Myotubes reflektierenInsulinsensitivität

Bei dieser Methode werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glukoseaufnahmeraten mit und ohne Insulinstimulation werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur quantitativen Bestimmung von passiven und aktiven Glukosetransportraten unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ ³ H] 2-Desoxy-D-Glucose ([ ³ H] 2dG). Berechnungsmethoden werden zur Quantifizierung der aktiven basalen und insulin-stimulierten Raten sowie der Stimulationsfalte bereitgestellt.

Introduction

Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Dieses Insulin reagierende Gewebe ist die primäre Stelle der Glukoseaufnahme, die durch Insulinstimulation ausgelöst wird ¹ .

Bei Typ-2-Diabetes wird die Insulinresistenz in mehreren Geweben, einschließlich des Skelettmuskels, beobachtet und führt zu einer übermäßigen Blutglukosekonzentration. So ist es von großer Bedeutung, den Grad der Insulinsensitivität dieses Gewebes und seiner Zellen zu bestimmen, ob es darum geht, einen Defekt eines Subjekts zu charakterisieren oder die Effizienz einer Behandlung zu beurteilen, die beabsichtigt, sie zu verbessern. Bei menschlichen oder tierischen Probanden ist die Gold-Standard-Technik zur Beurteilung der Insulinsensitivität die hyperinsulinämisch-euglykämische Klammer. Eingeführt von DeFronzo im Jahr 1979 ² und seit ^{3 , 4} geändert ^, dann erlaubt die Methode, den ganzen Körper zu quantifizierenNd Gewebe Insulin-Reaktionsfähigkeit gemessen als die Rate der Glukose, um unter Insulin-Stimulation perfundiert werden, um die normale Blutglukose-Konzentration zu erhalten.

Insulin-Sensitivitäts-Exploration kann auch auf der Zellebene unter Verwendung von In-vitro- Muskelmodellen durchgeführt werden, und die Messung der Glukose-Aufnahmeraten bleibt ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug, um die biologische Antwort der Zelle auf die Insulinstimulation ^{5 , 6 , 7} zu quantifizieren. In der Tat quantifiziert die Glukose-Aufnahme-Messung die zellbiologische Antwort auf Insulin-Stimulation, von der Bindung von Insulin an seinen Rezeptor an die Translokation von GLUT4 angereicherten Vesikeln und einschließlich intrazellulärer Signal- und Phosphorylierungskaskaden ⁸ .

Dies ist von großer Bedeutung für menschliche Proben, da differenzierte Myotubes viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich metabolischer EigenschaftenUnd Störungen, die bei Patienten ^{9 , 10 , 11 , 12 beobachtet wurden} . Die Myotubes zeigen strukturelle, metabolische und phänotypische Ähnlichkeiten mit dem Skelettmuskel ^{13 , 14} , einschließlich der Expression von Glukosetransportern ¹⁵ und der zellulären Insulin-Signalisierungsmaschine ¹⁶ . So ist die Messung der Glukoseaufnahme in primären Myotubes für die Charakterisierung des Muskelphänotyps eines Spenders relevant oder untersucht die Wirkung einer Intervention (Arzneimittel, Ernährung oder körperliche Aktivität) auf die Insulinsensitivität in der Muskelzelle.

Die Messung der Glukoseaufnahme auf kultivierten Myotubes ist auch ein zuverlässiges Werkzeug bei der Durchführung von Experimenten, die die Insulinsensitivität modifizieren ^{17 , 18} . Die in vitro </Em> Modell eignet sich für den Test von beliebigen Verbindungen, die die Insulinreaktionsfähigkeit verbessern könnten oder die erworbene oder induzierte Insulinresistenz ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23} verhindern oder umkehren könnten.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur und differenzieren menschliche Myotubes und zur Messung der Zellglukose-Aufnahmeraten. Die Methode gilt für jede Quelle von menschlichen Muskelvorläuferzellen, ob sie aus In-Labor-Präparaten, Collaboration oder kommerziell erhältlichen Lieferanten stammen. Immortalisierte Muskelzelllinien, wie C2C12 und L6, jeweils aus Maus- und Rattenursprung, können auch für die Glukoseaufnahme mit diesem Protokoll verwendet werden ⁷ .

Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und Insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ ³ H] 2dG. TDie Verwendung eines markierten Glukose-Analogons ermöglicht eine genaue Bestimmung des Glukoseeintritts mit reduziertem Ausgangsmaterial, ein gemeinsamer Zustand bei der Arbeit mit Primärzellen. Das modifizierte Glukosemolekül ist nicht in der Lage, metabolische Wege einzugehen und sich somit innerhalb der Zelle zu akkumulieren, was eine zuverlässige Quantifizierung über die gesamte Zellradioaktivität ermöglicht. Die experimentellen Bedingungen umfassen die Verwendung eines Glukose-Transport-Inhibitors (Cytochalasin B), und Messungen werden mit und ohne Insulin durchgeführt. Diese Kombination ermöglicht die Bestimmung der Glukose-Eintrittsraten sowie die Berechnung der Faltungsänderung für den Insulinreaktionsindex. Die Methode wird mit einer Dosis Insulin während einer einzigen Inkubationszeit präsentiert, aber das Protokoll kann leicht für Dosisreaktionen oder Zeitverlaufsexperimente modifiziert werden ¹² .

Protocol

1. Vorbereitung von Zellkulturmedien und -lösungen Vorbereitung von Kulturmedien Bereiten Sie das Proliferationsmedium (PM) vor, indem Sie das F-10-Medium von Ham mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 & mgr; g / ml Finale), 2% Fetal Calf Serum (FCS) und 2% Serumersatz ergänzen. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 μg / ml Finale) und 2% FCS…

Representative Results

Am Tag 3 erreichen Myoblasten Zusammenfluss ( Abbildung 1A ). Die Myoblasten sind in diesem Stadium typischerweise mononukleiert. Medium wurde geändert und am Tag 8 wurde die Differenzierung abgeschlossen ( Abbildung 1B ) (Protokollabschnitt 2). Nach 5 Tagen Differenzierung werden Myotubes ausgerichtet und typischerweise polynukleiert. Menschliche primäre Myotubes wurden einer Palmitat- oder einer BSA-Behandlung unterzogen, be…

Discussion

Die Glukoseaufnahme ist eine wichtige biologische Messung zum Testen von Aktivatoren oder Inhibitoren auf die Zellkultur und deren Auswirkungen auf die Verwendung von Glukose und die Fähigkeit der Zelle, auf Insulin zu reagieren. Die hier beschriebene Methode hat sich als schnell und zuverlässig erwiesen und wurde in vielen Studien mit primären Myotubes von gesunden Probanden und / oder metabolisch betroffenen Patienten ^{6 , 7 , 10…}

Materials

Human primary muscle cell	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	If not available, use commercial source
Human primary muscle cell	Promocell	C-12530	Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate	Corning	356400	BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10	Dutscher	L0145-500	1 g/l glucose
Glutamine	Dutscher	X0551-100
penicilin/streptomycin 100x	Thermo fisher scientific	15140122
Serum substitute UltroserG	Pall France	15950.017	serum substitute in text
DMEM low glucose	Dutscher	L0064-500	1 g/l glucose
Fetal Calf Serum	Eurobio	CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Dutscher	L0625-500	Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278
2-deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D6134
Albumin bovine	euromedex	04-100-812-E
fatty acid-free BSA	Roche	10,775,835,001
palmitate	Sigma-Aldrich	P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]	PerkinElmer	NET328A001MC	Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	c2743
PICO PRIAS VIAL 6ml	PerkinElmer	6000192
ultima gold MW CA	PerkinElmer	6013159	scintillation liquid
bêta counter	PerkinElmer	2900TR