Glukoseopptaksmåling og respons på insulinstimulering i<em> I Vitro</em> Dyrket humant primært myotubes

Summary

I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes og glukoseopptakshastigheter måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose.

Abstract

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Vurdering av insulinkänslighet av muskelceller har stor relevans for alle studier dedikert til å undersøke muskelglukosemetabolismen og karakteriserende metabolske endringer. I muskelceller translaterer glukosebærer type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som respons på insulin, slik at massiv innføring av glukose inn i cellen. Muskelcellers evne til å reagere på insulin ved å øke hastigheten på glukoseopptak er en av standardavlesningene for å kvantifisere muskelcellefølsomhet for insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- modell, da cellene opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert insulinfølsomhet. Denne in vitro- modellen er også egnet for test av eventuelle forbindelser som kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger av glukoseopptakshastigheten i differensierte myotubes reflektererInsulinfølsomhet.

I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes, og glukoseopptakshastigheter med og uten insulinstimulering måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere passive og aktive glukosetransporthastigheter ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose ([ ³ H] 2dG). Beregningsmetoder blir gitt for å kvantifisere aktive basale og insulinstimulerte frekvenser, samt stimuleringsfold.

Introduction

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Dette insulinresponsive vevet er det primære stedet for glukoseopptaket som utløses av insulinstimulering ¹ .

I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere vev, inkludert skjelettmuskulatur, og fører til over normal blodglukosekonsentrasjon. Således er det av stor betydning for å bestemme nivået av insulinfølsomhet for dette vevet og dets celler, enten målet er å karakterisere en defekt i et individ, eller å evaluere effektiviteten av en behandling som har til hensikt å forbedre den. I menneskelige eller dyrefag er gullstandardteknikken for å vurdere insulinfølsomhet hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme. Introdusert av DeFronzo i 1979 ² og modifisert siden ^{3 , 4} da tillater metoden å kvantifisere hele kroppen aNd vev insulinresponsivitet målt som graden av glukose som skal perfusjoneres under insulinstimulering for å opprettholde normal blodglukosekonsentrasjon.

Insulinsensitivitetsutforskning kan også utføres på cellenivå ved bruk av in vitro muskelmodeller, og måling av glukoseopptakshastigheter er fortsatt et effektivt og pålitelig verktøy for å kvantifisere den biologiske responsen til cellen til insulinstimulering ^{5 , 6 , 7} . Faktisk kvantifiserer glukoseopptaksmåling den cellebiologiske responsen på insulinstimulering, fra bindingen av insulin til dets reseptor til translokasjon av GLUT4-berikede vesikler, og inklusiv intracellulære signalerings- og fosforyleringskaskader ⁸ .

Dette er av stor interesse med humane prøver, da differensierte myotubes opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert metabolisk egenskapSymptomer og lidelser observert i pasienten ^{9 , 10 , 11 , 12} . Myotubene viser strukturelle, metabolske og fenotypiske likheter med skjelettmuskulaturen ^{13 , 14} , inkludert ekspresjonen av glukosetransportører ¹⁵ og det cellulære insulinsignaleringsmaskineri ¹⁶ . Målingen av glukoseopptaket i primære myotubes er derfor relevant for å karakterisere en donors muskelfenotype, eller undersøke effekten av en intervensjon (medikament, næring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheten i muskelcellen.

Måling av glukoseopptak på dyrkede myotubes er også et pålitelig verktøy når du utfører eksperimenter som endrer insulinfølsomhet ^{17 , 18} . In vitro </Em> -modellen er egnet til test av noen forbindelser som kan forbedre insulinresponsiviteten, eller kunne forhindre eller reversere oppnådd eller indusert insulinresistens ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23} .

Her beskriver vi en detaljert protokoll for kultur og differensiering av humane myotubes og for måling av celleglukoseopptakshastigheter. Metoden gjelder for hvilken som helst kilde til menneskelige muskelprecursorceller, enten de kommer fra in-lab preparater, samarbeid eller kommersielt tilgjengelige leverandører. Immortaliserte muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også brukes til glukoseopptaksmåling med denne protokollen ⁷ .

Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved hjelp av radiomerket [ ³ H] 2dG. THan bruker en merket glukoseanalog tillater nøyaktig bestemmelse av glukoseoppføring med redusert utgangsmateriale, en vanlig tilstand ved arbeid med primære celler. Det modifiserte glukosemolekylet er ikke i stand til å gå inn i metabolske veier, og akkumuleres således i cellen, slik at det tillates pålitelig kvantifisering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle forhold inkluderer bruk av en glukose transportinhibitor (cytokalasin B), og målinger utføres med og uten insulin. Denne kombinasjonen tillater bestemmelse av glukose aktive inngangsrater, samt beregning av foldendring for insulinresponsindeksen. Metoden presenteres med en dose insulin under en enkelt inkubasjonstid, men protokollen kan lett modifiseres for dose respons eller tidskursforsøk ¹² .

Protocol

1. Fremstilling av cellekulturmedier og -løsninger Fremstilling av kulturmedier Klargjør proliferasjonsmedium (PM) ved å supplere Hams F-10 medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / ml endelige), 2% føtalt kalvserum (FCS) og 2% serumsubstitutt. Forbered differensieringsmedium (DM) ved å supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL endelige) og 2% FCS. Fre…

Representative Results

På dag 3 når myoblastene sammenløp ( figur 1A ). Myoblastene på dette stadiet er vanligvis mononukleerte. Medium ble endret og på dag 8 ble differensiering fullført ( figur 1B ) (protokoll avsnitt 2). Etter 5 dager med differensiering er myotubene justert og typisk polynukleert. Humane primære myotubes ble utsatt for en palmitat eller en BSA-eneste behandling før glukoseopptakshastighetsmåling. Celler ble inkubert i 48 …

Discussion

Glukoseopptak er en viktig biologisk måling for testing av aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukosebruk, og cellens evne til å reagere på insulin. Metoden beskrevet her har vist seg å være rask og pålitelig og har blitt mye brukt i mange studier ved bruk av primære myotubes fra friske individer og / eller metabolisk berørte pasienter ^{6 , 7 , 10 , 12}…

Materials

Human primary muscle cell	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	In house preparation from human skeletal muscle biopsies	If not available, use commercial source
Human primary muscle cell	Promocell	C-12530	Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate	Corning	356400	BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10	Dutscher	L0145-500	1 g/l glucose
Glutamine	Dutscher	X0551-100
penicilin/streptomycin 100x	Thermo fisher scientific	15140122
Serum substitute UltroserG	Pall France	15950.017	serum substitute in text
DMEM low glucose	Dutscher	L0064-500	1 g/l glucose
Fetal Calf Serum	Eurobio	CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Dutscher	L0625-500	Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278
2-deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D6134
Albumin bovine	euromedex	04-100-812-E
fatty acid-free BSA	Roche	10,775,835,001
palmitate	Sigma-Aldrich	P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]	PerkinElmer	NET328A001MC	Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	c2743
PICO PRIAS VIAL 6ml	PerkinElmer	6000192
ultima gold MW CA	PerkinElmer	6013159	scintillation liquid
bêta counter	PerkinElmer	2900TR