Medição da captação de glicose e resposta à estimulação de insulina em miotubos primários humanos cultivados in vitro
Summary
Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados e as taxas de absorção de glicose são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado.
Abstract
O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. A avaliação da sensibilidade à insulina das células musculares é de grande relevância para todos os estudos dedicados a explorar o metabolismo da glicose muscular e caracterizar alterações metabólicas. Nas células musculares, as proteínas do transportador de glicose 4 (GLUT4) translocam para a membrana plasmática em resposta à insulina, permitindo assim a entrada maciça de glicose na célula. A capacidade das células musculares para responder à insulina, aumentando a taxa de captação de glicose é uma das leituras padrão para quantificar a sensibilidade das células musculares à insulina. Os miotubos primários humanos são um modelo in vitro adequado, uma vez que as células mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo a sensibilidade à insulina. Este modelo in vitro também é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam impactar a capacidade de resposta da insulina. As medições da taxa de absorção de glicose em miotubos diferenciados refletemSensibilidade à insulina.
Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados, e as taxas de absorção de glicose com e sem estimulação com insulina são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas de transporte de glicose passiva e ativa usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado ([3H] 2dG). Os métodos de cálculo são fornecidos para quantificar as taxas basais e estimuladas por insulina, bem como a dobra de estimulação.
Introduction
O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. Este tecido responsivo à insulina é o principal local de captação de glicose que é desencadeado pela estimulação de insulina 1 .
Na diabetes tipo 2, a resistência à insulina é observada em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético, e conduz à concentração de glicose no sangue acima do normal. Assim, é de grande relevância para determinar o nível de sensibilidade à insulina deste tecido e suas células, quer seja para caracterizar um defeito em um sujeito, quer para avaliar a eficiência de um tratamento com o objetivo de melhorá-lo. Em indivíduos humanos ou animais, a técnica de padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina é o grampo hiperinsulinêmico-euglicêmico. Introduzido por DeFronzo em 1979 2 e modificado desde 3 , 4 então, o método permite quantificar todo o corpo aNd tecidos de resposta de insulina medida como a taxa de glicose a ser perfundida sob estimulação de insulina para manter a concentração normal de glicose no sangue.
A exploração da sensibilidade à insulina também pode ser realizada no nível celular usando modelos musculares in vitro e a medição das taxas de absorção de glicose continua sendo uma ferramenta eficiente e confiável para quantificar a resposta biológica da célula à estimulação de insulina 5 , 6 , 7 . De fato, a medida da absorção de glicose quantifica a resposta biológica celular à estimulação de insulina, desde a ligação da insulina ao seu receptor até a translocação de vesículas enriquecidas com GLUT4 e incluindo sinalização intracelular e cascatas de fosforilação 8 .
Isso é de grande interesse com amostras humanas, pois os miotubos diferenciados mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo propriedades metabólicasIes e distúrbios observados no paciente 9 , 10 , 11 , 12 . Os miotubos apresentam semelhanças estruturais, metabólicas e fenotípicas com o músculo esquelético 13 , 14 , incluindo a expressão de transportadores de glicose 15 e a maquinaria de sinalização de insulina celular 16 . Assim, a medição da absorção de glicose em miotubos primários é relevante para caracterizar o fenótipo muscular de um doador, ou investigar o efeito de uma intervenção (medicamento, nutrição ou atividade física) na sensibilidade à insulina na célula muscular.
A medida da absorção de glicose em miotubos cultivados também é uma ferramenta confiável ao realizar experimentos que modificam a sensibilidade à insulina 17 , 18 . O in vitro </Em> modelo é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam melhorar a capacidade de resposta da insulina, ou poderia prevenir ou reverter a resistência à insulina adquirida ou induzida 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a cultura e diferenciamos os miotubos humanos e medimos as taxas de absorção de glicose celular. O método é aplicável a qualquer fonte de células precursoras de músculo humano, sejam eles provenientes de preparações em laboratório, colaboração ou fornecedores comercialmente disponíveis. As linhas celulares musculares imortalizadas, como C2C12 e L6, respectivamente, de origem de rato e rato, também podem ser usadas para medição de absorção de glicose com este protocolo 7 .
Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [3H] 2dG radiomarcado. TO uso de um análogo de glicose rotulado permite uma determinação precisa da entrada de glicose com material de partida reduzido, uma condição comum ao trabalhar com células primárias. A molécula de glicose modificada é incapaz de entrar em caminhos metabólicos e, assim, se acumula dentro da célula, permitindo quantificação confiável através da radioatividade celular total. As condições experimentais incluem o uso de um inibidor do transporte de glicose (citocalasina B), e as medidas são realizadas com e sem insulina. Esta combinação permite a determinação das taxas de entrada ativa da glicose, bem como o cálculo da variação da dobra para o índice de resposta à insulina. O método é apresentado com uma dose de insulina durante um único tempo de incubação, mas o protocolo pode ser facilmente modificado para experiências de resposta a dose ou tempo 12 .
Protocol
Representative Results
Discussion
A absorção de glicose é uma medida biológica fundamental para testar ativadores ou inibidores na cultura celular e como eles afetam o uso de glicose e a capacidade da célula de responder à insulina. O método descrito aqui mostrou-se rápido e confiável e tem sido amplamente utilizado em muitos estudos usando miotubos primários de indivíduos saudáveis e / ou pacientes metabólicamente afetados 6 , 7 , 10 ,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem Anne Charrié no serviço de Radiobiologia (hospital Lyon-Sud) e Fond National Suisse (FNS) pelo apoio financeiro.
Materials
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/l glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/l glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6ml | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
References
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
