दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना
Summary
हम दो सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो सेल चक्र के विशिष्ट चरणों से संबंधित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए संदर्भ प्रदान करते हैं। हम यह दिखाते हैं कि इस दृष्टिकोण में एक विशिष्ट तंत्रिका के विनियमन का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, जो कि अघोषित सेल चक्र में या सेल चक्र को प्रभावित करने वाले एजेंटों के संपर्क में है।
Abstract
सेल चक्र की जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम सेल चक्र-निर्भर प्रक्रियाओं और कैंसर जैसी बीमारियों में उनकी भूमिका को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सेल सिंक्रनाइज़ेशन पर विशिष्ट चरणों में निर्भर करता है। यहां हम दो पूरक सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए एक विधि का वर्णन करते हैं जो सामान्यतः सेल चक्र के दौरान जीन एक्सप्रेशन के आवधिक भिन्नता के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। दोनों प्रक्रियाएं एक परिभाषित बिंदु में सेल चक्र को अवरुद्ध रूप से अवरुद्ध करने पर आधारित हैं। हाइड्रोक्स्यूरिया (एचयू) के उपचार के द्वारा सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल, अंत में G1 / प्रारंभिक एस चरण में सेलुलर गिरफ्तारी की ओर जाता है, और एचयू-मध्यस्थता की गिरफ्तारी से रिहाई एक सेलुलर आबादी प्रदान करती है जो समान रूप से एस और जी 2 / एम के माध्यम से प्रगति कर रही है। थिइमिडीन और नोकोडाज़ोल (ते-एनओसी) के द्वारा सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल प्रारंभिक माइटोसिस में कोशिकाओं को ब्लॉक करता है, और तेरा-एनओसी मध्यस्थता से गिरफ्तारी से रिलीज जी 1 चरण और एस चरण एन के लिए उपयुक्त एक सिंक्रनाइज़ सेलुलर आबादी प्रदान करता हैअध्ययन की कोशिश करो दोनों प्रक्रियाओं के आवेदन के लिए सेल चक्र वितरण प्रोफाइल की निगरानी की आवश्यकता होती है, जिसे आम तौर पर कोशिकाओं के प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला होने और डीएनए सामग्री के प्रवाह कोशिकीमितीय-मध्यस्थता विश्लेषण के बाद किया जाता है। हम दिखाते हैं कि दो सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल का संयुक्त उपयोग सेल चक्र ( यानी ई 2 एफ 1 और ई 2 एफ 7) में भिन्न रूप से नियंत्रित जीन के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को स्पष्ट रूप से निर्धारित करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है, और परिणामस्वरूप सेल चक्र में उनकी भूमिका को बेहतर समझने के लिए प्रक्रियाओं। इसके अलावा, हम यह दिखाते हैं कि यह दृष्टिकोण दवा-आधारित चिकित्सा ( यानी मिटोमोसीन सी, एक एंटीकैंसर एजेंट) के अंतराल के तरीकों के अध्ययन के लिए उपयोगी है, क्योंकि यह उन जीनों को भेदभाव करने की अनुमति देता है जो केवल सेल चक्र संबंधी परेशानियों से प्रभावित जीनोटॉक्सिक एजेंट के प्रति संवेदनशील हैं एजेंट द्वारा लगाए गए
Introduction
सेल चक्र के सभी चरणों में संक्रमण एक कसकर विनियमित जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के साथ जुड़ा हुआ है। यह माना जाता है कि पूरे चक्र के दौरान जीन प्रतिलेखन के "चालू और बंद" जटिल ट्रांसक्रिप्शनल नियामक प्रणालियों के नियंत्रण के अधीन है, न केवल समय पर भी जीन अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करता है। प्रमुख सेल चक्र अवयवों का नियामक कई रोगों के विकास में योगदान के लिए जाना जाता है और ट्यूमोरिजिनेसिस 1 , 2 का एक अच्छी तरह से स्थापित पहचान है। खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में किए गए जीनोम-विस्तृत ट्रांसस्क्रिप्टमिक विश्लेषण से पता चला है कि बड़ी संख्या में जीन कोशिका चक्र में आवधिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न दर्शाती है, यह दर्शाता है कि सेल चक्र के दौरान ट्रांसक्रिप्शनल अस्थिरता एक जीन उत्पाद की अस्थायी आवश्यकता का प्रतिबिंब है एक सटीक चरण 3 , 4 , </suP> 5
कोशिका चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में एक प्रमुख कार्य विशिष्ट कोशिका चक्र चरणों में कोशिकाओं का सिंक्रनाइज़ेशन है। सेल सिंक्रनाइज़ेशन एक विशेष सेल चक्र चरण संक्रमण के लिए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के संघ की व्याख्या में मदद करता है, और इससे कई जीनों के विनियमन और कार्य की बेहतर समझ प्राप्त हुई है। एंटीकैन्सर ड्रग्स की कार्रवाई के तंत्र का अध्ययन करने के लिए सेल सिंक्रनाइज़ेशन भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि केमोथरेप्यूटिक एजेंट्स दोनों जीन एक्सप्रेशन के साथ-साथ सेल चक्र कैनेटीक्स 6 , 7 को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं। फिर भी, यह निर्धारित करना अक्सर मुश्किल होता है कि इन एजेंटों के साथ जीन एक्सरसाइज के मतभेदों के परिणाम उपचार के लिए प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया होती है या केवल सेल चक्र प्रोफाइल में होने वाले परिवर्तनों का नतीजा है। इन संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कोशिकाओं में किया जाना चाहिए जो कि एस रहे हैंकेमोथेरेप्यूटिक दवा को जोड़ने से पूर्व ynchronized
ताजे पृथक लिम्फोइड कोशिकाओं जैसे कुछ प्राथमिक कोशिकाओं के अपवाद के साथ- जो जी -08 में सिंक्रनाइज़ एक समरूप सेल आबादी का निर्माण होता है, इन विट्रो स्थापित सेल लाइनों में संस्कृति में अतुलनीय रूप से बढ़ता है। नियमित विकास की स्थिति के तहत, ये अतुल्यकालिक साइकिल चालन कक्ष सेल चक्र के सभी चरणों में पाए जाते हैं, लेकिन G1 9 में अधिमान्य रूप से इसलिए, यह संदर्भ विशिष्ट सेल चक्र चरण ( जैसे जी 1, एस आदि) में कार्यात्मक या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक इष्टतम परिदृश्य प्रदान नहीं करता है। गैर-रूपांतरित अमर सेल लाइनें ( जैसे फाइब्रोब्लास्ट्स) तथाकथित शारीरिक तरीकों 10 के साथ सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है ये पद्धतियां गैर-रूपांतरित कोशिकाओं के बनाए रखा प्राथमिक सेल सुविधाओं पर आधारित होती हैं, जैसे कि सेल-संपर्क निषेध और वृद्धि कारक निर्भरता ताकि साइक्लिंग जारी रहे। निष्कासनसंपर्क निषेध के साथ सीरम के संयोजन में जी -0 / जी 1 में गिरफ्तार गैर-रूपांतरित कोशिकाओं को प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, सिंक्रनाइज़ किए गए सेल चक्र प्रविष्टि और प्रगति में अक्सर उपसंस्कृति की आवश्यकता होती है, जिसमें कोशिकाओं के कृत्रिम टुकड़ी और पुन: चढ़ाना 10 भी शामिल है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि, यह पद्धति ट्रांसफॉर्मेड सेल लाइनों के सिंक्रनाइज़ेशन के लिए उपयुक्त नहीं है, जो वर्तमान में उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों का विशाल बहुमत है, जो कि सेल संपर्क-मध्यस्थता के विकास की निषेध या विकास कारक वापसी की प्रतिक्रिया की कमी के कारण होती है। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि सेल चक्र के विशिष्ट चरणों में कुशल सेल तुल्यकालन के लिए वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है। सामान्य शब्दों में, अक्सर उपयोग किए जाने वाले सिंक्रनाइज़ेशन विधियां सेल चक्र के एक परिभाषित बिंदु के क्षणिक रासायनिक या औषधीय अवरोधन पर आधारित होती हैं, आमतौर पर डीएनए संश्लेषण या मैटोटिक स्पिंडल संरचना। डीएनए संश्लेषण के निषेध कोशिकाओं को देर जी 1 या शुरुआती एस चरण में गिरफ्तार करके उन्हें सिंक्रनाइज़ करता है। यह achi हो सकता हैन्युक्लिओटाइड बायोसिंथेसिस 11 , 12 , एफीडिकोलिन का अवरोध करने वाला, डीएनए पॉलीमर 13 , 14 , हाइड्रॉक्स्यूरिया का अवरोध करने वाला , रिबन्यूक्लॉइड रीडक्टेस 15 , 16 का अवरोधक या थाइमिडीन 17 , 18 की अधिक मात्रा के द्वारा यौगिकों के अलावा मिमोसिन के रूप में शामिल किया गया। दूसरी ओर, माइक्रोटुबुल पॉलिमराइजेशन के अवरोधक, जैसे कोलिन्सिसिन या एनकोडाज़ोल, एमटोसिसिक स्पिंडल संरचना को अवरुद्ध करने में सक्षम हैं, जो कि प्रारंभिक एम चरण 1 9 , 20 , 21 में सेल सिंक्रनाइज़ेशन के लिए अग्रणी होते हैं।
इस कार्य में हम एमआरएनए में कोशिका चक्र-विनियमित जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए क्षणिक रासायनिक अवरोध के आधार पर दो पूरक सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल शामिल करने वाली विधि का वर्णन करते हैंस्तर। विशिष्ट सेल चक्र प्रक्रियाओं में सेल चक्र जीन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए यह विधि मौलिक है। इसके अलावा, यह एंटीकैंसेचर उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दवा के प्रति संवेदनशील जीनों को सही ढंग से पहचानने और इन दवाओं द्वारा उत्पन्न सेल चक्र की प्रगति में उलझाव से उत्पन्न गलत तरीके को कम करने के लिए सामान्य फ्रेम प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल चक्र में क्षणिक और विशिष्ट भूमिकाओं में शामिल ठीक धुन विनियमित जीनों का विश्लेषण एक समान सेल आबादी की आवश्यकता है। कई शोधकर्ता नियमित रूप से इन उद्देश्यों के लिए लंबे समय से स्थापित ट्यूमर सेल ला?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी चर्चाओं और तकनीकी सहायता के लिए जुबियागा और Altmeyer प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद करते हैं। यह काम स्पैनिश मंत्रालय (एसएएफ2015-67562-आर, मिनएको / फेडर, यूई), बास्क सरकार (आईटी 634-13 और केके-2015/8 9) और बास्क देश यूपीवी / ईएचयू विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित था ( UFI11 / 20)।
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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