Studiare l'espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule
Summary
Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.
Abstract
Il programma di espressione genica del ciclo cellulare rappresenta un passo fondamentale per comprendere i processi dipendenti dal ciclo cellulare e il loro ruolo in malattie come il cancro. L'analisi dell'espressione genica a ciclo-regolazione cellulare dipende dalla sincronizzazione cellulare in fasi specifiche. Qui descriviamo un metodo che utilizza due protocolli complementari di sincronizzazione comunemente usati per studiare la variazione periodica dell'espressione genica durante il ciclo cellulare. Entrambe le procedure sono basate sul blocco temporaneo del ciclo cellulare in un punto definito. Il protocollo di sincronizzazione con il trattamento con idrossiurea (HU) porta all'arresto cellulare nella fase tardiva G1 / fase iniziale S e la liberazione dall'arresto mediato da HU fornisce una popolazione cellulare che procede uniformemente attraverso S e G2 / M. Il protocollo di sincronizzazione da parte di timidina e nocodazolo (Thy-Noc) blocca le cellule in fase iniziale di mitosi e rilascio da arresto mediato da Thy-Noc fornisce una popolazione cellulare sincronizzata adatta per la fase G1 e la fase SProva gli studi. L'applicazione di entrambe le procedure richiede il monitoraggio dei profili di distribuzione del ciclo cellulare, che viene tipicamente eseguito dopo la colorazione del ioduro di propidium (PI) delle cellule e l'analisi della citometria a flusso analizzata del contenuto del DNA. Mostriamo che l'uso combinato di due protocolli di sincronizzazione è un approccio robusto per determinare chiaramente i profili trascrizionali di geni regolati in modo differenziato nel ciclo cellulare ( cioè E2F1 e E2F7) e di conseguenza avere una migliore comprensione del loro ruolo nel ciclo cellulare processi. Inoltre, dimostriamo che questo approccio è utile per lo studio di meccanismi che stanno alla base di terapie a base di droga ( cioè mitomicina C, un agente anticancro), perché consente di discriminare i geni che rispondono all'agente genotossico da quelli esclusivamente colpiti dalle perturbazioni del ciclo cellulare Imposto dall'agente.
Introduction
La transizione attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare è accoppiata ad un programma di espressione genica fortemente regolamentato. Si ritiene che questa coordinata "on and off" della trascrizione genica per tutto il ciclo cellulare sia sotto il controllo di sistemi regolatori transcrittivi complessi, che regola non solo la tempistica ma anche i livelli di espressione genica. La deregulation dei componenti chiave del ciclo cellulare è noto per contribuire allo sviluppo di diverse malattie ed è un segno distintivo ben consolidato della tumorigenesi 1 , 2 . Le analisi trascrizionali a livello genomico effettuate nelle cellule di lieviti e mammiferi hanno rivelato che un gran numero di geni mostrano pattern periodici di espressione genica nel ciclo cellulare, suggerendo che la fluttuazione trascrizionale durante il ciclo cellulare è un riflesso del requisito temporale di un determinato prodotto genico In una fase precisa 3 , 4 , </suP> 5 .
Un compito importante nello studio dell'espressione genica del ciclo cellulare è la sincronizzazione delle cellule in fasi specifiche del ciclo cellulare. La sincronizzazione delle cellule aiuta a interpretare l'associazione di un modello di espressione genica a una particolare transizione di fase del ciclo cellulare e ha portato ad una migliore comprensione della regolazione e della funzione di numerosi geni. La sincronizzazione cellulare è anche importante per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci antitumorali, in quanto gli agenti chemioterapici sono noti per influenzare sia l'espressione genica, sia la cinetica del ciclo cellulare 6 , 7 . Tuttavia, è spesso difficile determinare se le differenze di espressione genica risultanti dal trattamento con questi agenti sono una risposta diretta al trattamento o sono semplicemente la conseguenza dei cambiamenti nei profili del ciclo cellulare. Per distinguere tra queste possibilità, l'espressione genica deve essere analizzata in cellule che sono state sYnchronized prima dell'aggiunta del farmaco chemioterapico.
Ad eccezione di alcune cellule primarie come le cellule linfoidi appena isolate, che costituiscono una popolazione cellulare omogenea sincronizzata in G08, le linee cellulari stabilite in vitro crescono in modo asincrone nella cultura. In condizioni di crescita regolare, queste cellule cicliche asincrono si trovano in tutte le fasi del ciclo cellulare, ma preferibilmente in G1 9 . Pertanto, questo contesto non fornisce uno scenario ottimale per analisi funzionale o di espressione genica in una fase specifica del ciclo cellulare ( ad esempio G1, S, ecc.). Le linee cellulari immortalizzate non trasformate ( ad es. Fibroblasti) possono essere sincronizzate con i cosiddetti metodi fisiologici 10 . Questi metodi sono basati sulle caratteristiche delle cellule primarie mantenute delle cellule non trasformate, come l'inibizione del contatto cellulare e la dipendenza del fattore di crescita per continuare la ciclizzazione. RimozioneDel siero in combinazione con inibizione del contatto rende le cellule non trasformate arrestate a G0 / G1. Tuttavia, l'ingresso e la progressione del ciclo cellulare sincronizzato richiede spesso la subcultura, che prevede anche il distacco artificiale delle cellule e la ri-placcatura 10 . Il più importante, questo metodo non è adatto per la sincronizzazione di linee cellulari trasformate, la stragrande maggioranza delle linee cellulari esistenti attualmente in uso, caratterizzata per la mancanza di inibizione della crescita mediata dal contatto cellulare o risposta al ritiro del fattore di crescita. Quindi, è chiaro che sono necessari metodi alternativi per un'efficiente sincronizzazione delle cellule in fasi specifiche del ciclo cellulare. In termini generali, i metodi di sincronizzazione più utilizzati sono basati sull'inibizione chimica o farmacologica transitoria di un punto definito del ciclo cellulare, tipicamente la sintesi del DNA o la formazione di mandrini mitotici. L'inibizione della sintesi del DNA sincronizza le cellule arrestandole nella fase tardiva G1 o in fase iniziale S. Questo può essere achiEvitando l'aggiunta di composti come mimosina, inibitore della biosintesi nucleotida 11,12, afidicolina, inibitore delle DNA polimerasi 13 , 14 , idrossiacuri, inibitore della ribonucleotide reduttasi 15 , 16 o in eccesso di timidina 17 , 18 . D'altra parte, gli inibitori della polimerizzazione del microtubulo, come la colchicina o il nocodazolo, sono in grado di bloccare la formazione di mandrini mitotici che conducono alla sincronizzazione cellulare all'inizio della fase M 19 , 20 , 21 .
In questo lavoro descriviamo un metodo che coinvolge due protocolli complementari di sincronizzazione basati sull'inibizione chimica transitoria per studiare l'espressione dei geni regolati dal ciclo cellulare all'MRNAlivello. Questo metodo è fondamentale per definire il ruolo dei geni del ciclo cellulare nei processi specifici del ciclo cellulare. Inoltre, fornisce un quadro generale per studiare l'impatto dei trattamenti antitumorali al fine di rilevare accuratamente i geni reattivi di droga e minimizzare le interpretazioni erronee derivanti da perturbazioni nella progressione del ciclo cellulare generato da questi farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'analisi dei geni regolati a fine sintonia coinvolti in ruoli transitori e specifici nel ciclo cellulare richiede una popolazione cellulare uniforme. Molti ricercatori utilizzano rutinamente linee di cellule tumorali di lunga durata per questi scopi e sono state sviluppate vari metodi per ottenere popolazioni di cellule sincrone (o parzialmente sincrone), allo scopo di accumulare il maggior numero di cellule in fasi definite di ciclo cellulare. Inoltre, sono stati intrapresi forti sforzi per migliorare e ottimizzar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Zubiaga e dei laboratori Altmeyer per un utile colloquio e per un supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del ministero spagnolo (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), del governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e dell'Università del Paese basco UPV / EHU UFI11 / 20).
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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