2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究
Summary
我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。
Abstract
細胞周期の遺伝子発現プログラムは、細胞周期依存性プロセスおよび癌などの疾患におけるそれらの役割を理解するための重要なステップである。細胞周期調節遺伝子発現分析は、特定の段階への細胞の同期化に依存する。ここでは、細胞周期中の遺伝子発現の周期的変動を研究するために一般的に使用される2つの相補的な同期プロトコールを利用する方法を説明する。両方の手順は、定義された1つの点で細胞周期を一時的にブロックすることに基づいています。ヒドロキシ尿素（HU）処理による同期プロトコールは、G1 /初期S期後期に細胞停止をもたらし、HU媒介停止からの放出は、SおよびG2 / Mを介して一様に進行する細胞集団を提供する。チミジンおよびノコダゾール（Thy-Noc）処理による同期プロトコルは、初期有糸分裂において細胞をブロックし、Thy-Noc媒介停止からの放出は、G1期およびS期に適した同調細胞集団を提供する研究を試してみてください。両方の手順を適用するには、典型的には細胞のヨウ化プロピジウム（PI）染色およびフローサイトメトリーによるDNA含量分析の後に行われる細胞周期分布プロファイルのモニタリングが必要である。我々は、2つの同期プロトコルの併用は、細胞周期（ すなわち、 E2F1およびE2F7）において差次的に調節される遺伝子の転写プロファイルを明確に決定し、その結果、細胞周期におけるそれらの役割のより良い理解を有するプロセス。さらに、このアプローチは、遺伝毒性物質に応答する遺伝子を、細胞周期摂動のみによって影響を受ける遺伝子と区別することを可能にするため、薬物療法（ すなわち、抗癌剤）の基礎を成すメカニズムの研究に有用であることを示す。エージェントによって課される。
Introduction
細胞周期の全ての段階を経る移行は、厳密に調節された遺伝子発現プログラムに結合される。この細胞周期を通しての遺伝子転写の「オン・オフ」調整は複雑な転写調節系の制御下にあると考えられ、タイミングだけでなく遺伝子発現のレベルも調節する。重要な細胞周期成分の調節解除は、いくつかの疾患の発症に寄与していることが知られており、腫瘍形成の確立された特徴である1,2 。酵母および哺乳動物細胞で実施されたゲノムワイド転写物解析は、細胞周期中の周期的な遺伝子発現パターンを示し、細胞周期中の転写変動が所定の遺伝子産物の時間的要求を反映していることを示唆している正確なフェーズ3,4 、 </sup> 5 。
細胞周期制御遺伝子発現の研究における主要な課題は、細胞の特定の細胞周期段階への同期化である。細胞の同期化は、特定の細胞周期相転移に対する遺伝子発現パターンの関連を解釈するのに役立ち、多数の遺伝子の調節および機能のより良い理解をもたらしている。化学療法剤は遺伝子発現だけでなく細胞周期動態にも影響することが知られているので、細胞の同期は抗癌剤の作用メカニズムを研究する上で重要である6,7 。それにもかかわらず、これらの薬剤による治療から生じる遺伝子発現の差異が治療に対する直接的な応答であるのか、または単に細胞周期プロファイルの変化の結果であるのかを決定することはしばしば困難である。これらの可能性を区別するために、遺伝子発現は、化学療法薬の添加に先立ってニンクロナイズした。
新たに単離されたリンパ球様細胞（G08に同調した均質な細胞集団を構成する）のようないくつかの初代細胞を除いて、 インビトロで確立された細胞株は培養において非同期的に増殖する。通常の増殖条件下では、これらの非同期循環細胞は、細胞周期の全ての段階において、しかしG1 9において優先的に見出される。したがって、この文脈は、特定の細胞周期段階（ 例えば、 G1、Sなど）における機能的または遺伝子発現分析のための最適なシナリオを提供しない。非形質転換不死化細胞株（ 例えば、線維芽細胞）は、いわゆる生理的方法10と同期させることができる。これらの方法は、サイクリングを続けるために、細胞接触阻害および増殖因子依存などの非形質転換細胞の保持された一次細胞の特徴に基づく。除去G0 / G1で停止した非形質転換細胞をもたらす。しかし、同期した細胞周期の進入および進行には、しばしば継代培養が必要であり、これには細胞の人工的分離および再メッキも含まれる。最も重要なことに、この方法は、形質転換細胞株（現在使用されている確立された細胞株の大部分）の同期には適しておらず、細胞接触媒介性増殖阻害または成長因子離脱に対する応答が欠如していることが特徴である。従って、細胞周期の特定の段階における効率的な細胞同期のために代替の方法が必要であることは明らかである。一般に、最も頻繁に使用される同期方法は、細胞周期の1つの定義された点、典型的にはDNA合成または有糸分裂紡錘体形成の一時的な化学的または薬理学的阻害に基づく。 DNA合成の阻害は、G1後期または初期のS期に細胞を停止させることによって細胞を同期させる。これはアーチかもしれないミオシン、ヌクレオチド生合成阻害剤11,12 、アフィジコリン、DNAポリメラーゼの阻害剤13,14 、ヒドロキシ尿素、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤15,16または過剰量のチミジン17,18 などの化合物を添加することによって得られる。他方、コルヒチンまたはノコダゾールのような微小管重合の阻害剤は、初期M期の細胞同期につながる有糸分裂紡錘体形成をブロックすることができる19,20,21。
この研究では、mRNAにおける細胞周期調節遺伝子の発現を研究するための一過性化学阻害に基づく2つの相補的同期プロトコールを含む方法を記載するレベル。この方法は、特定の細胞周期プロセスにおける細胞周期遺伝子の役割を定義するための基本である。さらに、薬物応答性遺伝子を正確に検出し、これらの薬物によって生じる細胞周期進行の摂動から生じる誤解を最小限に抑えるために、抗癌治療の影響を研究するための一般的なフレームを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞周期における一過性および特異的役割に関与する微調整された遺伝子の分析は、均一な細胞集団を必要とする。多くの研究者は、これらの目的のために長年確立された腫瘍細胞株を日常的に使用しており、定義された細胞周期段階において可能な限り多くの細胞を蓄積する目的で、同期（または部分的に同期した）細胞集団を得るための様々な方法が開発されている。さらに、確立され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはZubiagaとAltmeyer研究所のメンバーに、有益な議論や技術サポートに感謝します。この作業は、スペイン国務省（SAF2015-67562-R、MINECO / FEDER、UE）、バスク政府（IT634-13およびKK-2015/89）、およびバスク国UPV / EHU大学のグラントUFI11 / 20）。
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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