Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll
Summary
Vi rapporterar två cellsynkroniseringsprotokoll som tillhandahåller ett sammanhang för att studera händelser relaterade till specifika faser av cellcykeln. Vi visar att detta tillvägagångssätt är användbart för att analysera regleringen av specifika gener i en ostoppad cellcykel eller vid exponering för medel som påverkar cellcykeln.
Abstract
Gencyklusprogrammet för cellcykeln representerar ett kritiskt steg för att förstå cellcykelberoende processer och deras roll i sjukdomar som cancer. Cellcykelsreglerad genuttrycksanalys beror på cellsynkronisering i specifika faser. Här beskriver vi en metod som använder två komplementära synkroniseringsprotokoll som vanligtvis används för att studera periodisk variation av genuttryck under cellcykeln. Båda förfarandena är baserade på att blockcykeln blockerar cellcykeln i en definierad punkt. Synkroniseringsprotokollet med hydroxiurea (HU) -behandling leder till cellulär arrestering i sen G1 / early S-fas, och frisättning från HU-medierad arrestering ger en cellpopulation ensartad framsteg genom S och G2 / M. Synkroniseringsprotokollet genom tymidin och nokodazol (Thy-Noc) -behandling blockerar celler i tidig mitos, och frisättning från Thy-Noc-medierad arrestering ger en synkroniserad cellulär population lämplig för G1-fas och S-fas-enFörsök studier. Applicering av båda förfarandena kräver övervakning av cellcykeldistributionsprofilerna, vilket typiskt utförs efter propidiumjodid (PI) -färgning av cellerna och flödescytometri-medierad analys av DNA-innehåll. Vi visar att den kombinerade användningen av två synkroniseringsprotokoll är ett robust tillvägagångssätt för att tydligt bestämma transkriptionsprofilerna för gener som differentiellt regleras i cellcykeln ( dvs E2F1 och E2F7) och följaktligen att få en bättre förståelse för deras roll i cellcykeln processer. Vidare visar vi att detta tillvägagångssätt är användbart för studier av mekanismer som ligger till grund för läkemedelsbaserade terapier ( dvs mitomycin C, ett anticancermedel), eftersom det tillåter att diskriminera gener som är mottagliga för det genotoxiska medlet från de som endast påverkas av cellcykelstörningar Införd av agenten.
Introduction
Övergång genom alla faser av cellcykeln är kopplad till ett tätt reglerat genuttrycksprogram. Denna koordinerade "på och av" av gentranskription genom cellcykeln antas vara under kontroll av komplexa transkriptionsregleringssystem, som reglerar inte bara tidpunkten utan även nivåerna av genuttryck. Deregulering av viktiga cellcykelkomponenter är känd för att bidra till utvecklingen av flera sjukdomar och är ett väl etablerat kännetecken för tumörigenesen 1 , 2 . Genomförda transkriptomiska analyser utförda i jäst- och däggdjursceller har visat att ett stort antal gener uppvisar periodiska genuttrycksmönster i cellcykeln, vilket tyder på att transkriptionsfluktuationer under cellcykeln är en återspegling av det tidsmässiga kravet för en given genprodukt I en exakt fas 3 , 4 , </suP> 5 .
En viktig uppgift i studien av cellcykelsreglerat genuttryck är synkroniseringen av celler i specifika cellcykelfaser. Cellsynkronisering bidrar till att tolka association av ett genuttrycksmönster till en viss cellcykelfasövergång, och det har lett till en bättre förståelse av reglering och funktion hos flera gener. Cellsynkronisering är också viktig för att studera verkningsmekanismen hos antikankermedicin, eftersom kemoterapeutiska medel är kända för att påverka både genuttryck och cellcykelkinetik 6 , 7 . Det är emellertid ofta svårt att avgöra om genuttrycksskillnader som härrör från behandling med dessa medel är ett direkt svar på behandlingen eller är enbart konsekvensen av förändringar i cellcykelprofiler. För att skilja mellan dessa möjligheter ska genuttryck analyseras i celler som har varit sYnkroniseras före tillsats av det kemoterapeutiska läkemedlet.
Med undantag för några primära celler, såsom ny isolerade lymfoida celler, som utgör en homogen cellpopulation synkroniserad i G08, växer in vitro etablerade cellinjer asynkront i odling. Under vanliga tillväxtbetingelser finns dessa asynkront cykelceller i alla faser av cellcykeln men, företrädesvis i G1 9 . Därför ger detta sammanhang inte ett optimalt scenario för funktionella eller genuttrycksanalyser i en specifik cellcykelfas ( t.ex. G1, S etc.). Icke-transformerade immortaliserade cellinjer ( t ex fibroblaster) kan synkroniseras med så kallade fysiologiska metoder 10 . Dessa metoder är baserade på de kvarhållna primära cellegenskaperna hos icke-transformerade celler, såsom cellkontakthämning och tillväxtfaktorberoende för att fortsätta cykling. borttagningAv serum i kombination med kontaktinhibering gör icke-transformerade celler arresterade vid G0 / G1. Emellertid kräver synkroniserad cellcykelinträde och progression ofta subkultur, vilket också innefattar artificiell avlägsnande av cellerna och omplätering 10 . Viktigast är denna metod inte lämplig för synkronisering av transformerade cellinjer, den stora majoriteten av etablerade cellinjer som för närvarande används, kännetecknad av att den saknar cellkontaktmedierad tillväxtinhibering eller respons på tillväxtfaktoravdrag. Det är sålunda klart att alternativa metoder krävs för effektiv cellsynkronisering i specifika faser av cellcykeln. Generellt sett är de mest använda synkroniseringsmetoderna baserade på transient kemisk eller farmakologisk inhibering av en definierad punkt av cellcykeln, typiskt DNA-syntes eller mitotisk spindelbildning. Inhibering av DNA-syntes synkroniserar celler genom att arrestera dem i sen G1 eller tidig S-fas. Detta kan vara achiEved genom tillsats av föreningar såsom mimosin, en inhibitor av nukleotidbiosyntesen 11 , 12 , aphidikolin, en hämmare av DNA-polymeraser 13 , 14 , hydroxiurea, en inhibitor av ribonukleotidreduktas 15 , 16 eller med överskott av mängder tymidin 17 , 18 . Å andra sidan kan inhibitorer av mikrotubulapolymerisation, såsom kolchicin eller nokodazol, blockera mitotisk spindeldannande som leder till cellsynkronisering vid tidig M-fas 19 , 20 , 21 .
I detta arbete beskriver vi en metod som involverar två komplementära synkroniseringsprotokoll baserat på transient kemisk inhibering för att studera uttrycket av cellcykelsreglerade gener vid mRNAnivå. Denna metod är grundläggande för att definiera cellcykelgenernas roll i specifika cellcykelprocesser. Vidare ger den en allmän ram för att studera effekten av cancer mot cancer för att noggrant detektera läkemedelsreaktiva gener och för att minimera felinterpretationer härrörande från störningar i cellcykelförskjutning genererad av dessa läkemedel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analys av finjusterade reglerade gener som är involverade i övergående och specifika roller i cellcykeln kräver en likformig cellpopulation. Många forskare använder rutinmässigt etablerade tumörcellinjer för dessa ändamål och en rad olika metoder har utvecklats för att erhålla synkrona (eller delvis synkrona) cellpopulationer, i syfte att samla så många celler som möjligt i definierade cellcykelfaser. Dessutom har starka ansträngningar gjorts för att förbättra och optimera väletablerade synkroniseri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Zubiaga och Altmeyer laboratorierna för användbara diskussioner och för teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från det spanska ministeriet (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), den baskiska regeringen (IT634-13 och KK-2015/89) och universitetet i Baskien UPV / EHU ( UFI11 / 20).
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
- Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
- Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
- Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
- Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
- Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
- Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
- McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
- Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
- Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
- Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
- Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
- Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
- Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
- Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
- Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
- Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
- Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
- Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
- Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
- Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
- Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
- Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
- Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
- Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
- Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
- Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
- Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
- Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
- Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
- Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
- Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
- St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
- Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).
