Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.
서론
Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 ,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부
- 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다.
- 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다.
- 페트리 접시에 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ML을 부어, 또는 진드기가 완전히 잠길 때까지.
- 크기 11의 메스를 사용하여 눈의 꼭대기에서 진드기의 양쪽에있는 하단 꽃줄로 잘라냅니다.
- 살균 포셉을 사용하여 scutum 및 alloscutum을 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다.
- 오염을 방지하기 위해 미세한 흰색 실 모양의 기관 (기관) 및 기타 막을 제거하십시오.
- 포셉을 사용하여 위 부분을 집어 넣고시체. 다른 조직이 해부되지 않도록 나머지 조직을 제거하십시오.
- 염화칼슘과 단백 분해 효소 칵테일 (PIC)이 포함 된 마그네슘 설페이트가없는 얼음처럼 차가운 Hank 's Balanced Salt So....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 및 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포는 표본 전체에 단수 롭고 구형이며 매끄러운 표면 형태와 일정한 크기로 나타납니다. 소화관 세포 집단의 크기와 유형의 차이는 진드기가 완전히 충혈 된 성인으로 진행되면 더욱 분명해진다.
.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 에 대한 방어 항원으로 진드기 장 상피 세포 내에서 확인되었다.
상피 분리 방법론에 초점을 맞춘 이전의 간행물은 주로 척추 동물 또는 곤충류 9 , 11 , 12 ,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture & Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM 탄산염 버퍼 | 3.03 g, Na2CO3, 6.0 g NaHCO3, 1000 ml 증류수 pH 9.6 | ||
| 밀봉 캡이 있는 16 mL 원심분리 튜브 | Thermo Scientific | 3138-0016 | 그래디언트 250 µ 전에 얼음으로 냉각 |
| ; M 셀 스트레이너 | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) 액체 기판 시스템 ELISA | Sigma | T0440 | 4C |
| 30 % 과산화수소 | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20 % Tris-MOPS 젤 | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol 정제 | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50mL 팔콘 튜브 | 코닝 블루 | 30 x 115mm 스타일. 폴리프로필리엔 원추형 튜브. | |
| 70 &마이크로; M 세포 여과기 | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 여과지 | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| 해부 현미경 | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | 올림푸스 | 2.2.1.195 | 세포 이미지 소프트웨어 |
| 덕트 테이프 | 홈 핸디맨 | 48mm x 25mm 덕트 테이프 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - 프로토콜 EDTA |
| Amresco | 0105-500G | ||
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| 형광 현미경 | 올림푸스 | BX51 | |
| 오로쉴 | |||
| Dumont | #9 Dumont - Switerzland | ||
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516 | 분자생물학용 글리세롤 >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| 휴대용 카운터 | 사무국 | JA0376230 | |
| 행크' s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – 프로토콜 적혈구 계를 위한 얼음 차갑 |
| Optik Lakor | - | - | |
| L-글루타티온 산화 | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| 자기 분리 스탠드 | Novagen-4-Tube | 자기 분리 랙 | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | 용 일체형 정수 시스템 |
| 66485 | 30cm x 3M 순수 니트로셀룰로오스 멤브레인 | ||
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml 증류수) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| 연동 펌프 | Masterflex | 7518-10 | |
| 인산 | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS 차단 버퍼 | Thermo-Scientific | 37573 | 4C에서 보관. 차단 버퍼 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | 그림 – -20 °에 저장; C |
| 퀵 스타트 Bradford 염료 시약 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| 퀵 스타트 BSA 표준 | Biorad | 500-0207 | BSA 표준 Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM 염색 키트 | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ 초원심분리기 | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU UHU | Super Glue 1mg. Ultra Fast Mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | 써모 피셔 | 20490 | |
| 트리톤 X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| 트윈-20 | 시그마 | P2287-500ML | |
| 볼텍스 믹서 | Ratek | VM1 | |
| 수조 | 그랜트 | GD100 |
참고문헌
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
