Personlig nålar för Microinjections i gnagare hjärnan

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för Mikroskop i gnagare hjärnan som använder quartz nålar. Dessa nålar inte producera detekterbara vävnadsskada och säkerställa tillförlitlig leverans även i djupa regioner. Dessutom, de kan anpassas till behov av forskning av personlig design och kan återanvändas.

Abstract

Microinjections har använts under lång tid för leverans av läkemedel eller toxiner inom specifika hjärnområden och, mer nyligen, de har använts för att leverera gen eller cell terapi produkter. Tyvärr, aktuella Mikroskop tekniker använder stål eller glas nålar som är suboptimal av flera skäl: i synnerhet stål nålar kan orsaka vävnadsskada och glas nålar kan böja när sänkte djupt in i hjärnan, saknas i målregionen. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att förbereda och använda quartz nålar som kombinerar ett antal användbara funktioner. Dessa nålar producerar inte påvisbar vävnadsskada och som mycket styvt, säkerställa leveranssäkerhet i hjärnregionen önskad även när du använder djup koordinater. Dessutom är det möjligt att anpassa utformningen av nålen genom att göra flera hål av önskad diameter. Flera hål underlätta injektion av stora mängder lösning inom ett större område, stora hål underlätta injektion av celler. Dessutom, kan dessa kvarts nålar rengöras och återanvändas, så att förfarandet blir kostnadseffektiv.

Introduction

Microinjections har använts under lång tid för leverans av farmakologiskt aktiva föreningar för att modulera neuronal aktivitet i specifika hjärnområden. Dessutom, har de använts för att injicera gifter nära särskilt neuronala populationer, att efterlikna neurodegenerativa händelser kännetecknar vissa sjukdomar, till exempel 6-hydroxi-dopamin i nigrostriatala dopaminsystemet att efterlikna Parkinsons sjukdom ^{1 , 2} eller den immunotoxin 192 IgG saporin till lesion det kolinerga system³. Mer nyligen, Mikroskop förfaranden har använts för att leverera virala vektorer eller celler grafter för gen eller cell terapi av experimentella hjärnans sjukdomar^4,5.

Klassisk typ av nålar används i dessa studier är gjorda av rostfritt stål. Även lätt och praktisk att använda, stål nålar har ett antal problem⁶: de är relativt stora och kan orsaka vävnadsskada, med läckage av den blod – hjärnbarriären och aktivering av astrocyter; Dessutom kan de producera coring av hjärnvävnaden som får in nålen skapa ett hinder eller ens helt undvika flödet av den önska lösningen. Mer nyligen, Använd glas nålar beredda ad hoc- från kapillärerna har införts i^7,8. Dessa orsakar inte betydande vävnad skada heller Astrocyten aktivering, men är relativt flexibla och kan böja när introducerade i djupa strukturer, minska riktigheten av lokalisering (observationer).

Det finns därför ett behov av att minska så mycket som möjligt skador (särskilt när du utför experiment för att läka skador) samtidigt öka noggrannheten och reproducerbarheten (dvs.säkerställa att alla lösning levereras och säkerställa korrekt lokalisering). Dessutom skulle det vara önskvärt att använda olika nål mönster för att säkerställa optimal fördelning av den injicerade lösningen i hjärnområden med olika geometrier. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att förbereda och använda quartz nålar för microinjections i gnagare hjärnan. På grund av den höga smältpunkten, quartz kapillärer kan dras på en konventionell avdragare och därför inte har använts tidigare för att generera nålar. Kvarts, erbjuder dock vissa viktiga fördelar jämfört med glas, särskilt hög styvhet och bryta motstånd⁹. På grund av sin hårdhet passar quartz nålar perfekt för injektioner i ventrala hjärnregioner. På grund av sin höga motståndskraft mot brott kan de modelleras för att inkludera flera hål, få mönster som kan visa sig vara mest effektiva även när inriktning med komplexa geometrier¹⁰regioner i hjärnan.

Protocol

Alla experimentella protokoll godkändes av universitetet i Ferrara etiska kommittén för djur experiment och det italienska hälsoministeriet. ANLÄNDER (djur forskning: rapportering i Vivo experiment11) riktlinjer har följts. 1. beredning av kvarts nålar Rengör och sterilisera kvarts kapillärerna (se Tabell för material) genom att placera dem för 5 min i destillerat vatten, 5 min i etanol 99% och 5 min i dietyleter. Lämna k…

Representative Results

Vi jämförde skada inducerad av direkta Mikroskop i råtta dorsala hippocampus och striatum kvarts Barr (60 µM yttre diameter spets, en 20 µM diameter sida hål, typ C, figur 1) jämfört med två klassiker, 26 G trubbiga änden och 30 G avfasning edge rostfria nålar. I detta syfte vi injiceras 2 µL av aCSF i höger och vänster dorsala hippocampus och striatum med respektive kvartar och stål nålen och, 48 h efter injektion, vi utvärderat vävnadsskad…

Discussion

Tekniken som beskrivs i denna artikel uppfyller de behov som beskrivs i inledningen för att optimera microinjections som utförs för olika ändamål¹². De nålar som beskrivs här minska skador till ett minimum, i huvudsak icke-detekterbar nivå. på variansen med glas nålar (som är benägna att böja), kvarts nålar är stelbenta och säkerställa en tillförlitlig träff av önskad hjärnregionen även i djupa koordinater. Dessutom garanterar sidan hålet leverans av lösnin…

Materials

Quartz capillaries	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Without filament
Puller	Sutter	P2000
Micropipette storage jar	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Laser microdissector	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
Hamilton syringe	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany	19138-U
Microinfusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	Model 864
Manual microinjection pump kit	WPI	Item#: MMP-KIT	Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame
Precision Drill	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	Ball bearing drive shaft with variable speed
Artficial Cerebral Spinal Fluid	Tocris	3525
Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel	Hamilton	26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757
Microtome	Leica, Germany	LEICA RM212RT