Effecten van allogene Platelet-Rich Plasma (PRP) op het genezingsproces van verdeelde Achilles pezen voor ratten: een methodologische beschrijving
Summary
Dit protocol beschrijft het evaluatieproces van genezing van pezen bij ratten die zijn ingespoten met allogene platelet rich plasma (PRP) of zoutoplossing na het verwijderen van deel van de achillespees. De voortgang van de genezing van de pees wordt geëvalueerd op verschillende tijdstippen met behulp van verschillende types van analyses.
Abstract
Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om te observeren als PRP positief pees genezing beïnvloeden kunt. Er zijn 4 belangrijke stappen te volgen: induceren van een laesie in de achillespees; PRP bereiden en Injecteer het (of de zoutoplossing); Verwijder de pees; en biomechanische, moleculaire en histologische evaluaties uit te voeren. Bij elke stap, zijn alle procedures en methoden in detail beschreven, zodat deze gemakkelijk kan worden gereproduceerd.
Achilles pezen geweest operatief verdeelde (verwijdering van een lang stuk van 5 mm). Daarna werd PRP of zoutoplossing geïnjecteerd om te bestuderen of PRP een positief effect heeft op de genezing van de pees. Drie groepen van 40 dieren (totaal 120 ratten werden gebruikt in deze studie) werden onderverdeeld in 2 deelgroepen: PRP injectie groep en een zoutoplossing injectie controle groep. Ratten werden opgeofferd in toenemende tijd punten (groep A: 5 dagen; Groep B: 15 dagen; Groep C: 30 dagen) en pezen werden verwijderd. 90 pezen onderging biomechanische testen vóór het uitvoeren van analyses van de transcriptomic en de 30 resterende pezen aan histologische analyse werden voorgelegd.
Introduction
Stolling, inflammatoire processen en de immuniteit modulatie rollen van bloedplaatjes zijn bekende1. Meer recentelijk is gebleken dat ze ook herstellende eigenschappen2,3 hebben. Inderdaad, verschillende cytokines en groei factoren (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, en HGF) worden uitgebracht door trombocyten tijdens degranulatie. Deze factoren die de groei bevorderen angiogenese, weefsel remodeling en wond genezing (bot, huid, spier, pees)2. Centrifugeren autoloog bloed produceert bloedplaatjes rijk plasma (PRP), waarin hoge bloedplaatjes concentraties afhankelijk van de isolatie-methode (tussen 3 en 10 keer bloed concentraties van de basislijn). Inderdaad, geen verschillende PRP voorbereiding technieken een identieke eindproduct. Tot nu toe is er geen internationale algemene overeenstemming over deze kwestie bereikt. PRP zou over het algemeen een aantrekkelijke therapeutische optie voor de behandeling van chronische musculoskeletale aandoeningen, zoals tendinopathie, plantaire fasciitis, artrose en nonunion4. Het werd voor het eerst gebruikt in mondelinge chirurgie en implantologie4 te verbeteren en versnellen van de genezing na plaatsing van een tandheelkundig implantaat bot. In deze studie beschrijven we een reproduceerbare methode waarmee de verwerving van PRP voor dierproeven4.
Aangezien letsels van de pezen worden vaak waargenomen bij sporters en fysieke werknemers, verbetering van het genezingsproces en dus minder tijd voor herstel zijn van groot belang5. Nieuwe behandelmethoden die vaak ontwikkelen wordt gekenmerkt door het gebruik van groeifactoren, en het beheer van PRP is een eenvoudig en minimaal invasieve manier om het leveren van een mix van endogene groei factoren4.
Verscheidene in vitro of dierlijke studies hebben aangetoond dat de administratie van plasma met een hoog niveau van Trombocyten, door het vrijgeven van biologische bemiddelaars, pees en een ligament reparatie stimuleren kan door het vrijgeven van biologische bemiddelaars6 ,7,8,9. Bovendien, andere studies hebben aangetoond dat PRP kan het stimuleren van type I en III collageen synthese in pees cellen9,10,11. Er is ook gesuggereerd dat PRP kan de activering van matrix metalloproteinasen (MMP) verlagen en daardoor de afbraak van de matrix verminderen. Cellen die bij het proces van de ontsteking betrokken zijn kunnen produceren MMP-9, dat een rol speelt bij weefsel remodeling (fysiologische en pathologische) geïnduceerd door ontsteking12.
Op basis van deze informatie, veronderstelde wij dat een enkele PRP injectie in de verdeelde Achilles pezen van ratten het herstelproces en de mechanische sterkte van het gerepareerde weefsel verbeteren kan. Dit is getest door het meten van de biomechanische eigenschappen van de helende pezen tijdens het herstelproces en door het uitvoeren van de histologische en moleculaire analyses om te evalueren van collageen in het nieuw gevormde weefsel remodeling. Het doel van de studie was om te observeren als een enkele injectie van allogene PRP invloed kan zijn op de genezing van verdeelde Achilles pezen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bloedplaatjes zijn essentieel voor de vroege inflammatoire fase van de pees genezingsproces. Wanneer deze bloedplaatjes worden blootgesteld aan bindende weefsel of factoren die coagulatie veroorzaken, zal zij vrijgeven groeifactoren die zijn voorradig in α korrels. Als gevolg van deze interactie, extracellulaire matrix macromoleculen zijn synthetized en mesenchymale cellen vermenigvuldigen. Trombocyten hebben ook een Chemotactische activiteit op voorlopercellen in de bloedcirculatie, verbeteren van de angiogenese en het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door Standard de Liège en Lejeune – Lechien verleent van de Leon Frédéricq fondsen.
Materials
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -. C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -. F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -. F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
