के जैवप्रभावों को बनाए रखने और विभेद करने के लिए प्रयुक्त प्रयोगशाला तकनीक<em> विब्रियो कोलरे</em> नैदानिक और पर्यावरण अलगाव
Summary
यह पांडुलिपि, जैविक रासायनिक assays की एक श्रृंखला के अलावा उचित विब्रियो कोलरे रखरखाव तकनीकों का वर्णन करता है, सामूहिक रूप से क्लिनिकल और पर्यावरण वी के बीच त्वरित और विश्वसनीय अंतर के लिए उपयोग किया जाता है। एक प्रयोगशाला सेटिंग में कोलरे बायोटाइप।
Abstract
जलीय ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु विब्रियो कोलेरे संक्रामक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोग केजा के एटिऑलजिक एजेंट है। इस रोग की वैश्विक व्याप्ति और गंभीरता के कारण, वी । कोलेरे का पर्यावरण और प्रयोगशाला सेटिंग्स दोनों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, उचित रखरखाव और संवर्धन तकनीकों की आवश्यकता होती है। शास्त्रीय और एल टोर दो मुख्य जैव-प्रकार हैं जो वी बनाते हैं। कोलरे ओ 1 सेरोग्रुप, प्रत्येक अद्वितीय जीनोटाइपिक और फ़िनोटीपिक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं जो बायोटाइप लक्षण वर्णन के लिए विश्वसनीय तंत्र प्रदान करते हैं, और संवर्धन परिस्थितियों को प्रेरित करने के लिए अलग-अलग वायरस की आवश्यकता होती है। किसी भी संक्रमण या प्रकोप के कारण कारक तनाव के बायोटाइप के बावजूद, इस बीमारी के लिए मानक उपचार में रिहाइड्रेशन थेरेपी को एंटीबायोटिक दवाओं के एक आहार के साथ पूरक होता है। हालांकि, प्रयोगशाला अध्ययन के लिए बायोटाइप वर्गीकरण आवश्यक हो सकता है और बायोमेडिकल क्षेत्र में व्यापक प्रभाव पड़ सकता है।प्रारंभिक 2000 के नैदानिक आइसोलेट्स की पहचान की गई, जो शास्त्रीय और एल टोरी दोनों प्रकार के जीवों से जीनोटाइपिक और फ़िनोटीपिक लक्षण दिखाते हैं। एल टोर नामक नए पहचान वाले हाइब्रिड ने पिछले पारंपरिक एकल परख पहचान प्रोटोकॉल की तुलना में नैदानिक और पर्यावरणीय पृथक बायोटाइप पहचान को अधिक जटिल बनाने के लिए कारण दिया है। वी का वर्णन करने के अतिरिक्त कोलरे सामान्य रखरखाव और संवर्धन तकनीकों, यह पांडुलिपि जीन विशिष्ट ( सीटीएक्सबी और टीसीपीए ) पीसीआर-आधारित आनुवंशिक स्क्रीन और फ़िनोटीपीक एशेज (पॉलीमीक्सिन बी प्रतिरोध, साइट्रेट चयापचय, प्रोटीयोलाइटिक गतिविधि, हेमोलीटिक गतिविधि, गतिशीलता, और ग्लूकोस चयापचय के माध्यम से वाोग्स- प्रोस्काउर परख) सामूहिक रूप से शास्त्रीय और एल टोरी बायोटाइप के बीच अंतर करने और / या अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ में, इन assays एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक प्रभावी व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, या इसके अलावा, महंगा, श्रम से सशक्त प्रयोग चरित्र मेंवी । कोलरे नैदानिक (और पर्यावरण) अलग।
Introduction
हैजा, दूषित भोजन या जल के जल के ग्राम-नकारात्मक जीवाणु विब्रियो कोलेरे युक्त पानी की खपत के कारण दूर की छोटी आंत की बीमारी है। हैजा के लक्षणों में उल्टी और अनियंत्रित पानी का दस्त शामिल होता है, जिससे गंभीर निर्जलीकरण होता है, जो कि अगर ठीक से नहीं किया जाता है, तो मृत्यु हो जाएगी। वी । कोलेरे को सेल-सतह लाइपोपॉलीसेकेराइड ओ-एंटीजन की संरचना के आधार पर 200 से अधिक सरोर्गों में विभाजित किया जा सकता है। हालांकि, केवल 2 सेरोग्रुप, ओ 1 और ओ 139 ने महामारी या महामारी क्षमता 1 , 2 दिखायी है। इसके अलावा, सर्गोगाप O139 मुख्य रूप से दक्षिण एशिया 3 , 4 को पृथक कर दिया गया है, जबकि सर्गोग्रुप ओ 1 को दुनियाभर में वितरित किया गया है। इसके अलावा, ओ 1 सीरोग्रुप को 2 मुख्य बायोटाइप में विभाजित किया जा सकता है: शास्त्रीय और एल टोर। शास्त्रीय बायोटाइप पहले 6 हैजा के महामारी के लिए जिम्मेदार था1817 और 1 9 23 के बीच है। चालू सातवें महामारी एल गोंद बायोटाइप का परिणाम है, जिसने पर्यावरण 5 , 6 , 7 में क्लासिकल बायोटाइप को दुनिया भर में विस्थापित कर दिया है। हाल ही में, उपभेदों में उत्पन्न हुए हैं जिनमें शास्त्रीय और एल टोर दोनों 8 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 और दोनों के विशिष्ट गुण हैं जिनमें से एल टोर 13 , 17 के रूप में कहा गया है। कुछ एल तोर वेरिएंट ने पहले की तुलना में अधिक तीव्र और गंभीर बीमारी की प्रगति के साथ एलाइटेड वैरुलेंस क्षमताओं का प्रदर्शन किया, बल दियाएजेंट की पहचान और रोग की रोकथाम और उपचार के लिए एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण की आवश्यकता 8 , 9 , 18 जबकि बायोटाइप पहचान तुरंत उपचार को निर्देशित नहीं करती है, वैक्सीन के विकास और भावी चिकित्सकीय एजेंटों में आगे बढ़ने से बायोटाइप भेदभाव से लाभ हो सकता है।
यहां सूचीबद्ध प्रोटोकॉल की पहली श्रृंखला जांचकर्ताओं को उचित रूप से बनाए रखने में सक्षम होगी। एक प्रयोगशाला सेटिंग में कोलेरे की उपभेद एकरूपता और बाद के विश्लेषण में स्टॉक तैयारी और आइसोलेट्स के विकास की आवश्यकता होती है, जो बायोटाइप-निर्भर नहीं है। हालांकि, अतिसंवेदनशील जीन अभिव्यक्ति को बेहतर रूप से प्रेरित करने के लिए, स्वतंत्र बायोटाइप विशिष्ट संवर्धन तकनीक को 1 9 की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न आनुवंशिक और जैव रासायनिक assays की तैयारी इस पांडुलिपि में उल्लिखित हैं।
कोरा टोक्सिन (सीटी) और विष को-सहग्रुलेट प्लीयस (टीसीपी) वी के दोनों बायोटाइप में मास्टर नियामक टोक्सटी द्वारा नियंत्रित दो मुख्य विषम कारक हैं। कोलेरे ओ 1 सेरोगroup 20 सीटी पांच सीटीएक्सबी से बना एक द्विपक्षीय विष है एक एकल सीटीएक्सए सबयूनेट के आसपास के सब यूनिट, और हैजा से संबंधित तीव्र इलेक्ट्रोलाइट हानि के लिए जिम्मेदार है। टीसीपी टीसीपी ऑपेरॉन ( टीसीपीएबीएसीएसीडीआरडीएसटीईएफ़ ) द्वारा एन्कोडेड एक प्रकार का IV प्लीज है , और इसे बाहर की छोटी आंत की लगाव और उपनिवेश में शामिल किया गया है। टीसीपीए टीसीपी ओपेरॉन का पहला जीन है जो पिलियस 8 के निर्माण के लिए जरूरी निजी पियलिन सबिनट्स को एनकोड करता है। सीटीएक्सए के लिए जीन अनुक्रम शास्त्रीय और एल टोरी बायोटाइप्स के बीच पूरी तरह से संरक्षित है, जबकि सीटीएक्सबी और टीसीपीए दो बायोटाइपों में भिन्न है लेकिन प्रत्येक बायोटाइप 8 में संरक्षित हैं। सीटीएक्सबी पूरी तरह से बायोटेक्स्ट्स के बीच संरक्षित है, इसके अलावा दो आधार पॉजी को छोड़करप्रवृत्तियों (115 और 203) एल टोरी बायोटाइप में, थाइमाइन आधार स्थितियों 115 और 203 में रहता है, जबकि शास्त्रीय बायोटाइप इन बेस में साइटोसिन होता है। टीसीपीए पूरी तरह से प्रत्येक बायोटाइप के भीतर संरक्षित है, फिर भी बायोटाइप के बीच कई ठिकानों में अंतर है। ये आनुवांशिक भेद प्राथमिक बायोटाइप पहचान चिह्नक के रूप में कार्य करते हैं, और इन साइटों सहित पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रवर्धन उत्पाद को अनुक्रमित करने के बाद, अलग-अलग दृश्यों को बायोटाइप पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए वन्य-प्रकार (डब्ल्यूटी) शास्त्रीय O395 या WT El Tor N16961 से तुलना की जा सकती है सीटी और टीसीपी का, क्रमशः दिए गए वी । कोलरे में अलग।
शास्त्रीय और एल टोरी बायोटाइप्स 21 , 22 , 23 के बीच फ़िनोटीपिक भेदों को चिह्नित करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। पॉलीमीक्सिन बी एक पेप्टाइड एंटीबायोटिक है जो ग्राम-नकारात्मक बीएसी में बाह्य कोशिका झिल्ली की अखंडता का समझौता करता हैटेरिया और पॉलीमीक्सिन बी प्रतिरोध को पॉलीमीक्सिन बी प्रतिरोधी परख 21 के माध्यम से देखा जा सकता है। साइट्रेट क्रेब के चक्र का एक प्राथमिक सब्सट्रेट है, और साइटट्रेट चयापचय परख 22 का उपयोग करके एक एकल कार्बन स्रोत के रूप में साइट्रेट को मेटाबोलाइज करने की क्षमता निर्धारित की जा सकती है। एचएपीआर एक वैश्विक नियामक और वी। कोलरे, एचएपीआर में मास्टर कोरम-सेंसिंग नियामक को एन्कोड करता है, जो विभिन्न प्रमोटर क्षेत्र में बांधता है और जीन और ऑपरोन एक्सप्रेशन 24 को नियंत्रित करता है। वी। कोलेरे के कुछ रोगजनक उपभेदों में एचएपीआर जीन में एक स्वाभाविक रूप से उत्पन्न होने वाली फ्रेम-शिफ्ट उत्परिवर्तन होता है जिसके कारण इस घनत्व पर निर्भर विनियमन विषाणु जीन की अभिव्यक्ति 24 , 25 खो गई है। दूध एगर मीडिया का उपयोग करते हुए एचएपीआर-विनियमित प्रोटीज गतिविधि को मापने से शोधकर्ता को यह पता करने की अनुमति मिलती है कि क्या एक विशेष पृथक में एक कार्यात्मक एचएपीआर 23 है ।हेमोलिसिस परख के परीक्षण के लिए हेमोलिटेक एंजाइम को छिपाने के लिए एक तनाव की क्षमता होती है जो कि लाल रक्त कोशिकाओं को बोलती है; हेमोलिसिस की डिग्री रक्त एगर प्लेट्स 23 पर देखी जा सकती है। गतिशीलता अक्सर वी। कोलरे में खतरे के साथ जुड़ी होती है और गतिशीलता अगर प्लेट्स 23 का उपयोग करके इसका विश्लेषण किया जा सकता है। वाोग्स-प्रोस्काउर परख एक एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज को उत्तेजित करने और उप-उत्पाद एसीटोन 21 का उत्पादन करने की तनाव के लिए परीक्षण करता है। एल टोर के रूपांतरों के उद्भव के साथ, व्यापक जीनोटाइपिक स्क्रीनिंग के बिना किसी भी फेनोटाइपिक परख के परिणामों की भविष्यवाणी करना मुश्किल है, और वी के बायोटाइप पृष्ठभूमि को कम करने से पहले। कोलेरे आइसोलेट्स, यह सिफारिश की जाती है कि इस विधानसभा को 23 एसेशन के प्रदर्शन के लिए और परिणाम की तुलना तालिका 2 के संदर्भ में तनाव के रूप में करें।
इसके साथ ही, हम प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला को उन्नत कर चुके हैं, सामूहिक रूप से उपर्युक्त उपयोग करते हैंवी को चित्रित करने के लिए एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण के लिए ntioned जीनोटाइपिक और फ़िनोटाइपिक assays कोलरे बायोटाइप इसके अलावा, हमने ज्ञात वी के जीनोटाइपिक और फ़िनोटाइपिक भेदों का वर्णन किया है। कोलेरे एल टोर वेरिएंट (एमक्यू 1 9 5 और बीए -2163), आमतौर पर इस्तेमाल किए गए बायोटाइप संदर्भ तनाव (डब्ल्यूटी शास्त्रीय ओए 3 9 5, डब्लूटी एल टोर सी 6706, और डब्लूटी एल टोर एन 16961; तालिका 1 ) की तुलना में। एल टोर संस्करणों के उद्भव ने पहले से नियोजित एकल परख बायोटाइप वर्णक्रम प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता के लिए चुनौतियों का सामना किया है; हालांकि, यह कई परख पहचान प्रणाली क्लिनिकल और पर्यावरण वी के अधिक विश्वसनीय लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देगा। कोलरे आइसोलेट्स
Protocol
Representative Results
Discussion
200 से अधिक की पहचान वी । कोलरे सरोग्रुप, केवल O1 और O139 में महामारी संभावित है ओ 1 सरोग्रुप को दो बायोटाइप में विभाजित किया जा सकता है: शास्त्रीय और एल टोर। हालांकि, एल टोर 13 , 17 के रूप में</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल साइंसेज से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आईडीईए), पी 20GM103506 के माध्यम से न्यू हैम्पशायर-इनब्रे द्वारा समर्थित अनुसंधान
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
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| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
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| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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