Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em> Vibrio cholerae</em> Isolados clínicos e ambientais
Summary
Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório.
Abstract
A bactéria aquática Gram-negativa Vibrio cholerae é o agente etiológico da doença gastrointestinal infecciosa cólera. Devido à prevalência global e à gravidade desta doença, V. Cholerae tem sido amplamente estudado em ambientes ambientais e laboratoriais, exigindo técnicas adequadas de manutenção e cultura. Classical e El Tor são dois biótipos principais que compõem o V. Serogrupo de cholerae O1, cada um apresentando características genotípicas e fenotípicas únicas que fornecem mecanismos confiáveis para a caracterização de biótipos e requerem indução de condições de cultivo que induzem a virulência. Independentemente do biótipo da tensão causadora para qualquer infecção ou surto, o tratamento padrão para a doença envolve a terapia de reidratação suplementada com um regime de antibióticos. No entanto, a classificação do biótipo pode ser necessária para estudos laboratoriais e pode ter impactos mais amplos no campo biomédico.No início de 2000, foram identificados isolados clínicos que exibem traços genotípicos e fenotípicos de biótipos clássicos e El Tor. Os híbridos recentemente identificados, denominados variantes de El Tor, fizeram com que a identificação de biótodos isolados clínicos e ambientais se tornasse mais complexa do que os protocolos tradicionais de identificação de ensaio simples. Além de descrever V. Técnicas de manutenção e cultura geral de cholerae , este manuscrito descreve uma série de ecrãs genéticas baseadas em PCR específicas para genes ( ctxB e tcpA ) e testes fenotípicos (resistência a polimixina B, metabolismo de citrato, atividade proteolítica, atividade hemolítica, motilidade e metabolismo de glicose através de Voges- Ensaio Proskauer) usado coletivamente para caracterizar e / ou distinguir entre biótipos clássicos e El Tor. Juntos, esses ensaios fornecem uma abordagem sistemática eficiente para ser usada como alternativa ou, além disso, em experiências caras e intensivas em mão-de-obra na caracterizaçãoÇão de V. Isolados clínicos (e ambientais) de cholerae .
Introduction
A cólera é uma doença do intestino delgado distal causada pelo consumo de alimentos contaminados ou água contendo a bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae aquática. Os sintomas da cólera incluem vômitos e diarréia aquosa incontrolável, levando a desidratação severa, que, se não for tratada adequadamente, resultará em morte. V. Cholerae pode ser dividido em mais de 200 serogrupos com base na estrutura do antígeno O de lipopolissacarídeo de superfície celular. No entanto, apenas 2 sorogrupos, O1 e O139, mostraram potencial epidêmico ou pandêmico 1 , 2 . Além disso, o serogrupo O139 foi isolado principalmente no Sudeste Asiático 3 , 4 , enquanto o serogrupo O1 está distribuído em todo o mundo. Além disso, o sorogrupo O1 pode ser dividido em 2 biótipos principais: clássico e El Tor. O biótipo clássico foi responsável pela primeira pandemia de cólera 6Entre 1817 e 1923. A sétima pandemia em curso é resultado do biótipo El Tor, que deslocou globalmente o biótipo clássico no ambiente 5 , 6 , 7 . Recentemente, surgiram tensões que contêm características distintivas dos biótipos clássicos e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e desde então foram denominadas variantes 13 , 17 de El Tor. Algumas variantes de El Tor demonstraram capacidades de virulência elevadas com progressão de doença mais rápida e grave do que a observada anteriormente, enfatizandoA necessidade de uma abordagem mais abrangente para identificação de agentes e prevenção e tratamento de doenças 8 , 9 , 18 . Embora a identificação do biótipo não dê de imediato o tratamento, os avanços no desenvolvimento da vacina e nos futuros agentes terapêuticos podem beneficiar da distinção biótipo.
A primeira série de protocolos listados aqui permitirá que os investigadores mantenham corretamente V. Cepas de cólera em um ambiente de laboratório. Consistência e análise subseqüente requerem a preparação de estoque e o crescimento de isolados, o que não é biótipo-dependente. No entanto, para induzir de forma otimizada a expressão de genes de virulência, são necessárias técnicas de cultura de bioótipo independentes 19 . Além disso, a preparação para vários ensaios genéticos e bioquímicos é descrita neste manuscrito.
A toxina da cólera (CT) e a toxina co-rePilula gulosa (TCP) são dois principais fatores de virulência controlados pelo regulador mestre ToxT em ambos biótipos do V. Serogrupo 20 de cholerae O1. CT é uma toxina bipartida composta por cinco CtxB Subunidades envolvendo uma única subunidade CtxA, e é responsável pela perda rápida de eletrólito associada à cólera. TCP é um pilus tipo IV codificado pelo operão tcp ( tcpABQCRDSTEF ), e está envolvido na fixação e colonização do intestino delgado distal. TcpA é o primeiro gene do operão tcp que codifica as subunidades individuais de pilina essenciais para a construção do pilus 8 . A sequência de genes para ctxA é completamente conservada entre biótipos clássicos e El Tor, enquanto ctxB e tcpA diferem entre os dois biótipos, mas são conservados dentro de cada biótipo 8 . CtxB é completamente conservado entre biótipos, exceto em dois pontos básicos(115 e 203). No biótipo de El Tor, a timina reside nas posições de base 115 e 203, enquanto o biótipo clássico contém citosina nestas bases. TcpA é completamente conservado dentro de cada biótipo, mas diferem em bases múltiplas entre biótipos. Essas distinções genéticas servem como marcadores primários de identificação de biótipo e, depois de seqüenciar o produto de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo esses locais, as seqüências isoladas podem ser comparadas com O395 ou WT El Tor N16961 de tipo selvagem (WT) para determinar o fundo do biótipo De CT e TCP, respectivamente, em um isolado de V. cholerae .
Numerosos protocolos foram desenvolvidos para caracterizar as distinções fenotípicas entre os biótipos clássicos e El Tor 21 , 22 , 23 . A polimixina B é um antibiótico peptídico que compromete a integridade da membrana celular externa em bactérias Gram-negativasE a resistência à polimixina B podem ser visualizadas através do ensaio de resistência à polimixina B 21 . O citrato é um substrato primário do ciclo do Kreb e a capacidade de metabolizar o citrato como única fonte de carbono pode ser determinada utilizando o ensaio de metabolismo de citrato 22 . HapR codifica um regulador global e o regulador mestre de sensor de quorum em V. cholerae, HapR, que se liga a várias regiões promotoras e regula a expressão de genes e operões 24 . Algumas cepas patogênicas de V. cholerae têm uma mutação de mudança de quadro natural no gene hapR que causou a perda da densidade da expressão de genes da virulência 24 , 25 . Medir a atividade de protease regulada por HapR usando meios de agar de leite permite ao pesquisador identificar se um isolado particular contém um HapR 23 funcional. oTestes de análise de hemólise para a capacidade de uma cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisam glóbulos vermelhos; O grau de hemólise pode ser visualizado em placas de agar de sangue 23 . A mobilidade é freqüentemente associada à virulência em V. cholerae e pode ser analisada usando placas de ágar de motilidade 23 . O teste de Voges-Proskauer prova a capacidade de uma cepa para fermentar a glicose como única fonte de carbono e produzir o acetato de subproduto 21 . Com o surgimento de variantes de El Tor, é difícil prever os resultados de qualquer teste fenotípico dado sem rastreio genotípico extensivo e antes de deduzir o fundo biótipo de V. Isolados de cholerae , recomenda-se a realização desta montagem de ensaios 23 e compare os resultados com as cepas de referência como na Tabela 2 .
Aqui, avançamos uma série de protocolos, utilizando coletivamente o referidoEnsaios fenotípicos e fenotípicos referentes a uma abordagem mais abrangente para a caracterização de V. Biótipos de cólera . Além disso, descrevemos as distinções genotípicas e fenotípicas do V conhecido. Variantes de cholerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), em comparação com as estirpes de referência de biótopos comummente usadas (WT clássico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabela 1 ). O surgimento de variantes de El Tor apresentou desafios à confiabilidade de protocolos de caracterização de bióto simples de ensaio previamente empregados; No entanto, este sistema de identificação de múltiplos ensaios permitirá uma caracterização mais confiável do V clínico e ambiental. Isolados de cólera .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dos mais de 200 V identificados. Sorogrupos de colesterol, apenas O1 e O139 têm potencial de epidemia. O serogrupo O1 pode ser dividido em dois biótipos: clássico e El Tor. No entanto, emergiram as variedades híbridas, denominadas Variantes 13 , 17 de El Tor , que possuem o fundo do biótipo El Tor e apresentam características clássicas 8 , 9 , 10</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa apoiada por New Hampshire-INBRE através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA), P20GM103506, do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
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| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
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| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
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| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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