قياس كثافة من النظارات المائية في درجات الحرارة المبردة
Summary
ويرد وصف بروتوكول لتحديد كثافة المرحلة الزجاجية من قطرات حجم الصغير إلى بيكو لتر من مخاليط مائي في درجات الحرارة المبردة.
Abstract
علينا أن نظهر طريقة لتحديد المرحلة الزجاجية الكثافة المبردة درجات الحرارة من المخاليط المائية، وغيرها من العينات التي تتطلب التبريد السريع، لإعداد المرحلة درجة الحرارة المبردة المطلوبة. يتم تبريد ميكروليتر إلى قطرات بيكوليتر حجم الإسقاط في السائل النيتروجين الأرجون (N 2 -Ar) خليط. يتم تقييم المرحلة درجة الحرارة المبردة من انخفاض باستخدام مقايسة البصرية التي ترتبط مع قياسات حيود الأشعة السينية. يتم ضبط كثافة السائل N 2 -Ar خليط بإضافة N 2 أو أر حتى يصبح قطرة مزدهرة محايدة. يتم تحديد كثافة هذا الخليط وبالتالي من انخفاض باستخدام كتلة اختبار ومبدأ أرخميدس. مع الرعاية المناسبة في إعداد الإسقاط، وإدارة الغاز فوق خليط المبردة السائل للحد من الجليد، والخلط المنتظم للخليط المبردة لمنع الكثافة الطبقية وفصل المرحلة والكثافة دقيقة ل <0.5٪ من قطرات صغيرة مثل 50 بل يمكنبسهولة. القياسات على مخاليط كريوبروتكتانت المائية توفر نظرة ثاقبة العمل كريوبروتكتانت، وتوفير البيانات الكمية لتسهيل التوافق الحراري الانكماش في الحفظ بالتبريد البيولوجي.
Introduction
والخصائص الفيزيائية للمخاليط المائية والمائية في مراحلها المختلفة ذات أهمية أساسية، وهي مهمة في الجسم الحي وفي الفهم المختبري للنظم البيولوجية. في كريوبيولوغي المعاصرة والحفاظ على الحفظ بالتبريد البيولوجي، والمراحل الزجاجية أو غير متبلور من مخاليط كريوبروتكتانت المائية ذات أهمية خاصة 1 ، 2 . يمكن لنوى ونمو بلورات الثلج تعطيل الخلايا والأنسجة، وتعزيز تمسخ البروتين والتجميع، لذلك بروتوكولات الحفظ بالتبريد التي تزجج المذيبات أصبحت شعبية متزايدة. في البلورات الجزيئية البيولوجية، تبلور المذيبات في القنوات بين الجزيئات الحيوية يعطل المشابك الكريستال ويحلل خصائص الحيود. ويتحقق التزجيج من خلال مزيج من التبريد السريع، والجفاف، وإضافة المذيبات كريوبروتكتيف مثل الجلسرين، جلايكول الإيثيلين، جليكول البولي إثيلين (بيج)،والكحول، والأملاح.
التزجيج يحد من تبلور الجليد والنمو، ولكن لا يزيل جميع الأضرار عينة ذات الصلة التبريد. على سبيل المثال، فسيفساء الكريستال (مقياس لتوزيع التوجهات الطائرة الكريستال) يزيد بشكل روتيني بعامل من 10 إلى 100 عندما يتم تبريد بلورات البروتين إلى حالة مزججة 3 ، ومعدلات البقاء بعد الذوبان من الخلايا المنوية المزروعة والبويضات تختلف على نطاق واسع .
آلية الضرر واحد هو انكماش التفاضلي من المذيبات والمواد المحيطة بها أثناء التبريد 3 ، 4 ، 5 . إن توازن المذيبات وتركيزات المذاب داخل البلورة أو الخلية أو الأنسجة تعتمد على درجة الحرارة، وقد يتعاقد المذيب بالإضافة إلى المذاب والمواد المحيطة بكميات مختلفة. التبريد السريع قد يمنع المذيبات وإعادة المذيبات قبل التزجيج، و كونتراكتيونال كونتراكتي على قد يؤدي إلى كبير، غير متجانسة، وعدم وجود الضغوط التي تسبب تلف العينة.
ومن ثم يمكن أن تستفيد النهج المنطقية للحد من الأضرار الناجمة عن التبريد من معرفة كثافة تعتمد على درجة الحرارة من الخلائط المائية السائل والمزجج. في تركيزات المذابة فوق 50٪ من وزن المذاب إلى وزن الحل (ث / ث)، يمكن مزج معظم مخاليط كريوبروتكتانت المائية مع معدلات التبريد متواضعة من 10 K / ثانية أو أقل، مما يسمح لإنتاج وكثافة القياسات باستخدام عينات زجاجية كبيرة 6 . ويمكن بعد ذلك تحديد الكثافة باستخدام مبدأ أرخميدس، من خلال قياس الوزن الظاهري للعينة عند تعليقها في السائل المبردة مثل النيتروجين. ومع ذلك، ومع انخفاض تركيز المذيبات، تزداد معدلات التبريد المطلوبة للتزجيج بسرعة: تزداد معدلات تبريد مخاليط الغليسيرول المائية من <10 ك / ث عند وزن 50٪ من المذيبات في g إلى حجم المحلول بالمل / ث / إلى <1،000 K / s عند 25٪ ث / vأس = "كريف"> 7. يصبح نقل الحرارة حدود طبقة محدودة، بحيث تحقيق أكبر معدلات التبريد يتطلب أصغر وأصغر عينات 8 .
تم تحقيق قياسات كثافة الماء الزجاجي النقي والجليد بإيداع قطرات ميكروميتر (حجم الفمتولتر) في فراغ على سطح تبريد المبردة من أجل بناء عينة (كتلة غرامية) العيانية. تم تحديد كثافة هذه العينة عن طريق التسميد بالريوفلوتاتيون في خليط من النيتروجين – الأرجون السائل، حيث تم تعديل كثافة السائل المبرد حتى أصبحت العينة مزدهرة محايدة 9 . ومع ذلك، توليد عينات كبيرة من عدد كبير من قطرات صغيرة بطريقة يقلل من أحجام الفراغ – مصدرا هاما للخطأ في قياسات كثافة المرحلة الزجاجية السابقة – هو غير تافهة. بالنسبة للمخاليط المائية، يمكن أن يؤدي التبخر التفاضلي لمكونات المحلول أثناء الترسيب والترسب في الفراغ إلىشكوك كبيرة في تركيزات المودعة.
قمنا بتطوير طريقة، على أساس كريوفلوتاتيون، الذي يسمح تحديد كثافة دقيقة من مخاليط مائي باستخدام قطرات الفردية صغيرة مثل 50 بل 10 . ويمكن تبريد هذه القطرات بسرعة مع الحفاظ على تركيزاتها الأصلية، ويمكن تقييم حالة درجة الحرارة المبردة (المزججة أو البلورية) باستخدام مقايسة بصرية بسيطة ترتبط بقياسات حيود الأشعة السينية. هذه الطريقة تنطبق بشكل عام على المخاليط المائية وغير المائية، ويمكن أن تمتد إلى مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية بما في ذلك الخلايا (على سبيل المثال ، الجذعية والبيض)، وعينات الأنسجة، وبلورات البروتين وجود كثافة درجات الحرارة المنخفضة بين 0.8 و 1.4 غرام / مل.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجهاز الحالي والأساليب، التي وضعت في المقام الأول من قبل الطلاب الجامعيين مع محدودية الوصول إلى أدوات بناء الآلات والآلات، ومع ذلك يسلم قياسات الكثافة دقيقة للغاية للقطرات السائل الفردية صغيرة مثل 50 بل. في نطاق التركيز القريب وفوق 50٪ ث / ث، حيث معدلات التبريد الصغي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني تحت منح مسب-1330685. وتعترف دوم بدعم جزئي من منحة التدريب الجزيئي للفيزياء الحيوية لجامعة كورنيل (نيه T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
