Messung der Dichte von wässrigen Gläsern bei kryogenen Temperaturen
Summary
Ein Protokoll zur Bestimmung der Glaskapseldichten von Mikro- bis Pico-Liter-Größen-Tropfen von wässrigen Mischungen bei kryogenen Temperaturen wird beschrieben.
Abstract
Wir zeigen ein Verfahren zur Bestimmung der kryogenen Temperaturdichten der vitrusphasen von wässrigen Mischungen und anderer Proben, die eine schnelle Abkühlung erfordern, um die gewünschte kryogene Temperaturphase herzustellen. Mikroliter zu Picoliter-Größen-Tropfen werden durch Projektion in ein flüssiges Stickstoff-Argon (N 2 -Ar) -Mischung gekühlt. Die kryogene Temperaturphase des Tropfens wird unter Verwendung eines visuellen Assays ausgewertet, der mit Röntgenbeugungsmessungen korreliert. Die Dichte der flüssigen N 2 -Ar-Mischung wird durch Zugabe von N 2 oder Ar eingestellt, bis der Tropfen neutral schwimmfähig wird. Die Dichte dieser Mischung und damit des Tropfens wird nach einer Testmasse und dem Archimedes-Prinzip bestimmt. Mit geeigneter Sorgfalt bei der Tropfenvorbereitung, dem Management des Gases über dem flüssigen Kryogengemisch zur Minimierung der Vereisung und dem regelmäßigen Mischen des kryogenen Gemisches, um eine Dichte-Schichtung und eine Phasentrennung zu verhindern, können die Dichten auf <0,5% der Tropfen, die so klein wie 50 pl sind, genau seinLeicht bestimmt werden. Messungen an wässrigen Kryoschutzmittelgemischen liefern Einblicke in die Kryoschutzwirkung und liefern quantitative Daten zur Erleichterung der thermischen Kontraktionsanpassung in der biologischen Kryokonservierung.
Introduction
Die physikalischen Eigenschaften von Wasser und wässrigen Mischungen in ihren verschiedenen Phasen sind von grundlegender Bedeutung und sind für das in vivo und in vitro Verständnis der biologischen Systeme wichtig. In der zeitgenössischen Kryobiologie und der biologischen Kryokonservierung sind die glasartigen oder amorphen Phasen von wässrigen Kryoschutzmittelgemischen von besonderem Interesse 1 , 2 . Die Nukleierung und das Wachstum von Eiskristallen können Zellen und Gewebe stören und die Proteindenaturierung und Aggregation fördern, so dass Kryokonservierungsprotokolle, die das Lösungsmittel verglasen, zunehmend populär geworden sind. In der biomolekularen Kristallographie stört die Kristallisation des Lösungsmittels in den Kanälen zwischen Biomolekülen Kristallgitter und verschlechtert die Beugungseigenschaften. Die Verglasung wird durch eine Kombination aus Schnellkühlung, Dehydratisierung und Zugabe von kryoprotektiven Soluten wie Glycerin, Ethylenglykol, Polyethylenglykolen (PEGs),Alkohol und salze.
Die Verglasung begrenzt die Eiskristallisation und das Wachstum, eliminiert jedoch nicht alle kühlbedingten Probenschäden. Zum Beispiel erhöht die Kristallmosaik (ein Maß für die Verteilung der Kristallebenenorientierungen) routinemäßig um einen Faktor von 10 bis 100, wenn Proteinkristalle in einen verglasten Zustand 3 abgekühlt werden, und die Nachtrocknen-Überlebensraten von verglasten Spermien und Oozyten variieren stark .
Ein Schadensmechanismus ist eine differentielle Kontraktion von Lösungsmittel und umgebendem Material während der Kühlung 3 , 4 , 5 . Die Gleichgewichtslösungsmittel- und Lösungskonzentrationen innerhalb eines Kristalls, einer Zelle oder eines Gewebes sind temperaturabhängig, und das Lösungsmittel plus der gelöste und das umgebende Material kann sich durch unterschiedliche Mengen zusammenziehen. Die schnelle Abkühlung kann vor der Verglasung Lösungsmittel- und Lösungsumverteilung verhindern und Differentialverträge Kann zu großen, inhomogenen, Nichtgleichgewichtsbelastungen führen, die Probenschäden verursachen.
Rationale Ansätze zur Reduzierung von kühlbedingten Schäden könnten somit von der Kenntnis der temperaturabhängigen Dichten von flüssigen und verglasten wässrigen Gemischen profitieren. Bei Lösungskonzentrationen über 50 Gew .-% Lösemittel an Gewicht der Lösung (Gew./Gew.) Können die meisten wässrigen Kryoschutzmittelmischungen mit bescheidenen Abkühlgeschwindigkeiten von 10 K / s oder weniger verglast werden, was die Herstellung und die Dichtemessung mit großen Glaskörperproben ermöglicht. Die Dichte kann dann nach dem Archimedes-Prinzip bestimmt werden, indem man das scheinbare Gewicht der Probe misst, wenn es in einem flüssigen Kryogen wie Stickstoff suspendiert wird. Wenn jedoch die Konzentration des gelösten Stoffes abnimmt, steigen die für die Verglasung erforderlichen Abkühlgeschwindigkeiten rasch an: Die Abkühlgeschwindigkeiten für wässrige Glycerinmischungen steigen von <10 K / s bei 50 Gew .-% des gelösten Stoffes in g bis zum Volumen der Lösung in ml (w / v) bis> 1000 an K / s bei 25% w / vAss = "xref"> 7 Wärmeübertragung wird Grenzschicht begrenzt, so dass das Erreichen größerer Abkühlgeschwindigkeiten kleinere und kleinere Proben erfordert 8 .
Messungen der Dichte von reinem Glaskörper und Eis wurden durch Abscheiden von Mikrometer-Durchmesser (Femtoliter-Volumen) Tropfen im Vakuum auf eine kryogenisch gekühlte Oberfläche erreicht, um eine makroskopische (Gramm) Probe aufzubauen. Die Dichte dieser Probe wurde durch Kryoflotation in einer flüssigen Stickstoff-Argon-Mischung bestimmt, bei der die Dichte der kryogenen Flüssigkeit eingestellt wurde, bis die Probe neutral schwach wurde 9 . Allerdings ist die Erzeugung von großen Proben aus einer großen Anzahl von kleinen Tropfen in einer Weise, die Hohlraumvolumina minimiert – eine wichtige Fehlerquelle in früheren Glaskörper-Dichte-Messungen – ist nicht trivial. Für wässrige Mischungen kann die Differenzverdampfung von Lösungskomponenten bei der Aerosolisierung und Abscheidung im Vakuum dazu führenErhebliche Unsicherheiten bei abgelagerten Konzentrationen.
Wir haben eine Methode entwickelt, die auf Kryoflotation basiert und eine genaue Dichtebestimmung von wässrigen Mischungen mit einzelnen Tropfen ermöglicht, die so klein wie 50 pL 10 sind . Diese Tropfen können unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Konzentrationen schnell gekühlt werden, und ihr kryogener Temperaturzustand (verglast oder kristallin) kann mit einem einfachen visuellen Assay beurteilt werden, der mit Röntgenbeugungsmessungen korreliert. Dieses Verfahren ist weitgehend auf wässrige und nicht-wässrige Mischungen anwendbar und kann auf eine Vielzahl von biologischen Proben einschließlich Zellen ( z. B. Stamm und Ei), Gewebeproben und Proteinkristallen mit Niedrigtemperaturdichten zwischen 0,8 und 1,4 g / ML
Protocol
Representative Results
Discussion
Die derzeitigen Geräte und Methoden, die vor allem von Studenten mit eingeschränktem Zugang zu Instrumentenbauwerkzeugen und Maschinen entwickelt wurden, liefern dennoch hochgenaue Dichtemessungen für einzelne Flüssigkeitstropfen von nur 50 pL. In dem Konzentrationsbereich nahe und über 50% w / w, wo kleine Abkühlgeschwindigkeiten ausreichen, um keramische Proben zu erhalten, stimmen die Dichten mit denen überein, die in früheren Messungen an Massenproben erhalten wurden. Extrapolationen der vorliegenden Dichten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NSF unter der Auszeichnung MCB-1330685 unterstützt. DWM erkennt die Teilunterstützung von der Cornell University Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567) an.
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -. C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
