Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche
Summary
Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche.
Abstract
Abbiamo dimostrato un metodo per determinare le densità di temperatura criogenica a fase vitrea di miscele acquose e altri campioni che richiedono un raffreddamento rapido, per preparare la fase di temperatura criogenica desiderata. I microlitri a gocce di dimensioni del picoliter vengono raffreddate proiettando in una miscela di azoto liquido (N 2 -Ar). La fase di temperatura criogenica della goccia viene valutata usando un test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. La densità della miscela liquida N 2 -Ar viene regolata aggiungendo N 2 o Ar finché la goccia diventa neutrale. La densità di questa miscela e quindi della goccia è determinata usando una massa di prova e il principio di Archimede. Con la cura appropriata nella preparazione della goccia, la gestione del gas sopra la miscela criogenica liquida per ridurre al minimo la gelosia e la miscelazione regolare della miscela criogenica per prevenire la stratificazione della densità e la separazione di fase, le densità accurate a <0,5% di gocce minori di 50 pLFacilmente determinato. Le misurazioni sulle miscele crioprotettanti acquose permettono di conoscere l'azione crioprotrattante e fornire dati quantitativi per facilitare la corrispondenza della contrazione termica nella crioconservazione biologica.
Introduction
Le proprietà fisiche dell'acqua e delle miscele acquose nelle loro varie fasi sono di interesse fondamentale e sono importanti per la comprensione in vivo e in vitro dei sistemi biologici. Nella criobiologia contemporanea e nella crioconservazione biologica sono particolarmente interessanti le fasi vitreose o amorfe di miscele crioprotectanti acquose 1 , 2 . La nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio possono interrompere le cellule e i tessuti e promuovere la denaturazione e l'aggregazione delle proteine, per cui i protocolli di crioconservazione che vitrificano il solvente sono diventati sempre più popolari. Nella cristallografia biomolecolare, la cristallizzazione del solvente nei canali tra biomolecole distrugge i cristalli di cristallo e degrada le proprietà di diffrazione. La vitrificazione viene ottenuta attraverso una combinazione di rapido raffreddamento, disidratazione e aggiunta di solventi crioprotettori quali glicerolo, glicole etilenico, glicoli polietilenici (PEG),Alcoli e sali.
Vitrificazione limita la cristallizzazione e la crescita del ghiaccio, ma non elimina tutti i danni provenienti dal raffreddamento. Per esempio, la mosaicità di cristallo (una misura della distribuzione degli orientamenti del piano di cristallo) aumenta regolarmente di un fattore da 10 a 100 quando i cristalli proteici vengono raffreddati in uno stato vitrificato 3 e i tassi di sopravvivenza post-dissolti delle cellule spermatiche e degli ovociti vitrificati variano ampiamente .
Un meccanismo di danno è la contrazione differenziale del solvente e del materiale circostante durante il raffreddamento 3 , 4 , 5 . Il solvente di equilibrio e le concentrazioni di soluto all'interno di un cristallo, di una cellula o di un tessuto dipendono dalla temperatura e il solvente più il soluto e il materiale circostante possono contrattare per quantità diverse. Il raffreddamento rapido può impedire la ridistribuzione del solvente e del soluto prima della vitrificazione e dei contratti differenziali Può provocare grandi sollecitazioni inhomogenei e non equilibri che causano danni al campione.
Gli approcci razionali per la riduzione dei danni causati dal raffreddamento potrebbero quindi beneficiare della conoscenza delle densità dipendenti dalla temperatura delle miscele acquose liquide e vetrificate. A concentrazioni di solventi superiori al 50% del soluto al peso della soluzione (w / w), la maggior parte delle miscele crioprotectanti acquose possono essere vitrificate con modesti tassi di raffreddamento di 10 K / s o meno, permettendo la produzione e la misurazione di densità utilizzando grandi campioni di vitreo 6 . La densità può quindi essere determinata usando il principio di Archimede, misurando il peso apparente del campione quando sospeso in un criogenico liquido come l'azoto. Tuttavia, poiché la concentrazione del soluto diminuisce, i tassi di raffreddamento richiesti per la vitrificazione aumentano rapidamente: i tassi di raffreddamento per le miscele acquose di glicole aumentano da <10 K / s al 50% di soluto in g al volume di soluzione in ml (v / v) a> 1.000 K / s al 25% in pesoAss = "xref"> 7. Il trasferimento di calore diventa limitato per i livelli di confine, in modo che raggiungere grandi velocità di raffreddamento richiedano campioni più piccoli e minori 8 .
Le misure della densità dell'acqua e del ghiaccio puro sono state ottenute depositare gocce di diametro del micrometro (volume femtolitore) in un vuoto su una superficie criogenica raffreddata in modo da costruire un campione macroscopico (massa grammaticale). La densità di questo campione è stata determinata mediante crioflotazione in una miscela di azoto-argon liquido in cui è stata regolata la densità del liquido criogenico fino a quando il campione è diventato neutrale 9 . Tuttavia, generare grandi campioni da un gran numero di piccole gocce in modo da ridurre al minimo i volumi vuoti – una fonte importante di errore nelle precedenti misurazioni di densità di fase in vitreo – non è banale. Per miscele acquose, l'evaporazione differenziale dei componenti della soluzione durante l'aerosolizzazione e la deposizione in un vuoto può portare aConsistenti incertezze nelle concentrazioni depositate.
Abbiamo sviluppato un metodo basato su crioflotazione che consente una precisa determinazione della densità di miscele acquose utilizzando singole gocce minori di 50 pL 10 . Queste gocce possono essere rapidamente raffreddate pur mantenendo le loro concentrazioni originali e il loro stato di temperatura criogenica (vetrificato o cristallino) può essere valutato utilizzando un semplice test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. Questo metodo è ampiamente applicabile a miscele acquose e non acquose e può essere esteso ad una varietà di campioni biologici, incluse le cellule ( ad es . Stelo e uovo), campioni di tessuto e cristalli proteici aventi densità a bassa temperatura tra 0,8 e 1,4 g / mL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli attuali apparecchi e metodi, sviluppati principalmente da studenti universitari con accesso limitato a strumenti e macchine per la costruzione di strumenti, forniscono tuttavia misurazioni di densità estremamente accurate per singole gocce di liquidi minori di 50 pL. Nel campo di concentrazione vicino e al di sopra del 50% in peso, dove piccoli tassi di raffreddamento sono sufficienti per ottenere campioni vetrificati, le densità sono d'accordo con quelle ottenute nelle precedenti misurazioni sui campioni di m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NSF sotto il premio MCB-1330685. DWM riconosce un sostegno parziale dalla Grant di Formazione Molecolare Biofisica dell'Università Cornell (NIH T32GM0082567).
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
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