Måling av tetthetene av vandige briller ved kryogene temperaturer

Summary

En protokoll for å bestemme glassfettdensiteter av mikro- til pico-liter-størrelsesdråper av vandige blandinger ved kryogene temperaturer er beskrevet.

Abstract

Vi demonstrerer en metode for å bestemme krystalliske temperaturdensiteter i glassfasen av vandige blandinger og andre prøver som krever rask avkjøling for å fremstille den ønskede kryogeniske temperaturfase. Mikroliter til pikoliterstørrelsesdråper avkjøles ved fremspring i en flytende nitrogen-argon (N2-Ar) -blanding. Den kryogene temperaturfasen av dråpen blir evaluert ved hjelp av en visuell analyse som korrelerer med røntgendiffraksjonsmålinger. Tettheten av den flytende N ₂ -Ar-blandingen justeres ved å legge N ₂ eller Ar inntil dråpen blir nøytralt flytende. Tettheten av denne blandingen og dermed av dråpen bestemmes ved bruk av en testmasse og Archimedes-prinsipp. Ved passende behandling i dråpepreparat, håndtering av gass over væskenkryogenblandingen for å minimere isingen og regelmessig blanding av kryogenblandingen for å hindre tetthetstratifisering og faseseparasjon, tettheter nøyaktig på <0,5% dråper så små som 50 pL kanLett bli bestemt. Målinger på vandige kryobeskyttelsesblandinger gir innsikt i kryobeskyttende virkning og gir kvantitative data for å lette termisk sammentrekning i biologisk kryopreservering.

Introduction

De fysiske egenskapene til vann og vandige blandinger i deres forskjellige faser er av fundamental interesse, og er viktige for in vivo og in vitro forståelse av biologiske systemer. I moderne kryobiologi og biologisk kryopreservering er de glassformede eller amorfe faser av vandige kryobeskyttelsesblandinger av særlig interesse ^{1 , 2} . Nukleasjon og vekst av iskrystaller kan forstyrre celler og vev og fremme protein denaturering og aggregering, slik at kryopreserveringsprotokoller som fortynner løsningsmidlet, har blitt stadig mer populære. Ved biomolekylær krystallografi forstyrrer krystalliseringen av løsningsmiddel i kanalene mellom biomolekyler krystallgitter og nedbryter diffraksjonsegenskapene. Vitrifikering oppnås ved en kombinasjon av hurtig avkjøling, dehydrering og tilsetning av kryobeskyttende løsemidler som glyserol, etylenglykol, polyetylenglykoler (PEGs),Alkoholer og salter.

Vitrifikasjon begrenser iskrystallisering og vekst, men eliminerer ikke alle kjølerelaterte prøveskader. For eksempel øker krystallmosaiciteten (et mål for fordelingen av krystallplanretninger) rutinemessig med en faktor 10 til 100 når proteinkrystaller blir avkjølt til en forglasset tilstand ³ og etter-tine overlevelseshastigheter for forglassede spermceller og oocytter varierer mye .

En skade mekanisme er differensial sammentrekning av løsningsmiddel og omgivende materiale under kjøling ^{3 , 4 , 5} . Likevektsløsningsmidlet og løsningsmiddelkonsentrasjonene i en krystall, celle eller vev er temperaturavhengige, og løsningsmidlet pluss løsningsmidlet og omgivende materiale kan trekke sammen med forskjellige mengder. Hurtig avkjøling kan forhindre oppløsning av løsemiddel og løsemiddel før vitrifikasjon og differensialkontrakt På kan føre til store, inhomogene, ikke-likevektsbelastninger som forårsaker prøveskade.

Rasjonelle tilnærminger for å redusere kjøleinducerte skader kunne således ha nytte av kunnskapen om temperaturavhengige tettheter av flytende og forglassede vandige blandinger. Ved løsemiddelkonsentrasjoner over 50 vektprosent løsemiddel til vekt av oppløsning (vekt / vekt), kan de fleste vandige kryobeskyttelsesblandinger forglasses med beskjedne kjølingshastigheter på 10 K / s eller mindre, slik at produksjon av og tetthetsmålinger ved bruk av store glassplater ⁶ . Tettheten kan da bestemmes ved bruk av Archimedes 'prinsipp ved å måle den tilsynelatende vekten av prøven når den er suspendert i et flytende kryogen som nitrogen. Etter hvert som løselig konsentrasjon reduseres, øker kjølehastighetene for vitrifikasjon raskt. Kokehastighetene for vandige glycerolblandinger øker fra <10 K / s ved 50% vektoppløsning i g til volumløsning i mL (w / v) til> 1000 K / s ved 25% vekt / volumAss = "xref"> 7. Varmeoverføring blir begrenset av begrensning, slik at større kjølehastigheter krever mindre og mindre prøver ⁸ .

Målinger av tetthet av rent glassholdig vann og is har blitt oppnådd ved å avsette dråper med mikrometer-diameter (femtoliter volum) i et vakuum på en kryogenisk avkjølt overflate for å bygge opp en makroskopisk (grammasse) prøve. Tettheten av denne prøven ble bestemt ved kryoflotering i en flytende nitrogen-argonblanding, hvori tettheten av kryogen væske ble justert til prøven ble nøytralt flytende ⁹ . Imidlertid er det ikke-trivielt å generere store prøver fra et stort antall små dråper på en måte som minimerer tomromvolumer – en viktig kilde til feil i tidligere målinger av glassfase tetthet. For vandige blandinger kan differensial fordampning av løsningskomponenter under aerosolisering og avsetning i vakuum føre tilBetydelig usikkerhet i deponerte konsentrasjoner.

Vi har utviklet en metode basert på kryoflotasjon, som tillater nøyaktig tetthetsbestemmelse av vandige blandinger ved bruk av individuelle dråper så små som 50 pL10. Disse dråpene kan raskt avkjøles mens de opprettholder deres opprinnelige konsentrasjoner, og deres kryogeniske temperaturtilstand (forglasset eller krystallinsk) kan bli vurdert ved hjelp av en enkel visuell analyse som korrelerer med røntgendiffraksjonsmålinger. Denne fremgangsmåten er bredt anvendelig for vandige og ikke-vandige blandinger og kan utvides til en rekke biologiske prøver, inkludert celler ( f.eks . Stamme og egg), vevsprøver og proteinkrystaller med lavtemperaturtettheter mellom 0,8 og 1,4 g / ml.

Protocol

FORSIKTIG: Vennligst se alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Vennligst bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis ved bruk av komprimerte gasser, inkludert passende kalibrerte gasshåndteringsregulatorer og ventiler, og godkjent gassledning. Kontakt med flytende kryogener kan forårsake alvorlig frostbit og nekrose. Bruk egnet personlig verneutstyr (ansiktsskjold, hansker, laboratoriejakke, bukser med full lengde, lukkede sko), som alle må være ugjennomtrengelige for flytende nitrogen. Fortsett å stå o…

Representative Results

Densitetsmålinger ved T = 77 K for forglassede dråper med vandig glyserol og etylenglykol versus kryobeskyttende konsentrasjon er vist i henholdsvis figur 1 A og figur 1 B , og den tilsvarende endringen i spesifikt volum mellom T = 298 K og 77 K, beregnet ved bruk av tidligere Bestemt T = 298 K densiteter, er vist i figur 2 . Ved høye k…

Discussion

Foreliggende apparat og fremgangsmåter, utviklet primært av undergraduates med begrenset tilgang til instrumentbyggende verktøy og maskiner, leverer likevel svært nøyaktige tetthetsmålinger for individuelle væskedråper så små som 50 pL. I konsentrasjonsområdet i nærheten av og over 50% vekt / vekt, hvor små kjølehastigheter er tilstrekkelige for å oppnå forglassede prøver, stemmer densitetene med de som er oppnådd i tidligere målinger på bulkprøver. Ekstrapoleringer av nåværende tetthet til 0% kon…

Materials

centrifuge tube	Falcon	6029236	15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5%	Sigma	G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8%	Sigma	324558-100 mL
analytical microbalance	Mettler	AE240	Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance
vortexer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing	Unistrut	1-5/8" metal framing	48" wide x 24" deep x 40" tall
Apparatus enclosure air barrier			any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk			4" diameter, 1/8" thick
dewar flask	Scilogix Dilvac	SS333	4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber			This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas	Airgas	NI HP300	99.998% pure N2 gas
argon gas	Airgas	AR HP300	99.998% pure Ar gas
rotameter	Omega	FL3692ST	2.52 l/min max flow rate
foam insulating lid			This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".
PTFE test mass			This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end.
microbalance platform	Unistrut	1-5/8" metal framing	11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line	Berkley	NF1502-CM	Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing	VWR	60985-512	1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer			1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe	BD	309628	1 ml Luer-Lok tip syringe
vacuum generator	Gast	VG-015-00-00	compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray	RainX	620036	plastic water repellent
long focal length stereo microscope	Bausch and Lomb Stereozoom 6		0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance
LED ring illuminator	Amscope	LED144S
LED spot illuminator	Newhouse Lighting	NHCLP-LED	3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial	Nunc	V7634-500EA	Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate