Medindo as densidades de vidros aquosos em temperaturas criogênicas

Summary

É descrito um protocolo para determinar as densidades de fase vítrea de gotas de tamanho micro-a pico-litro de misturas aquosas em temperaturas criogênicas.

Abstract

Demonstramos um método para determinar a densidade de temperatura criogênica da fase vítrea de misturas aquosas e outras amostras que requerem arrefecimento rápido, para preparar a fase desejada de temperatura criogênica. As gotas de Microliter para picoliter são arrefecidas por projecção para uma mistura líquida de azoto-árgon (N2-Ar). A fase de temperatura criogênica da gota é avaliada usando um ensaio visual que se correlaciona com as medições de difracção de raios X. A densidade da mistura líquida de N ₂ -Ar é ajustada adicionando N ₂ ou Ar até que a queda se torne neutra. A densidade desta mistura e, portanto, da queda é determinada usando uma massa de teste e o princípio de Arquimedes. Com o cuidado apropriado na preparação de gotas, gerenciamento de gás acima da mistura líquida de criogênio para minimizar a formação de gelo e mistura regular da mistura criogênica para evitar a estratificação da densidade e a separação de fases, densidades precisas de <0,5% de gotas tão pequenas quanto 50 pL podemProntamente seja determinado. As medições sobre misturas crioprotectoras aquosas fornecem informações sobre a ação crioprotectora e fornecem dados quantitativos para facilitar a combinação de contração térmica na criopreservação biológica.

Introduction

As propriedades físicas da água e das misturas aquosas nas suas diversas fases são de interesse fundamental e são importantes para a compreensão in vivo e in vitro dos sistemas biológicos. Na criobiologia contemporânea e na criopreservação biológica, as fases vítrea ou amorfa de misturas crioprotectoras aquosas são de particular interesse ^{1 , 2} . A nucleação eo crescimento de cristais de gelo podem perturbar células e tecidos e promover a desnaturação e agregação de proteínas, de modo que os protocolos de criopreservação que vitrificam o solvente tornaram-se cada vez mais populares. Na cristalografia biomolecular, a cristalização do solvente nos canais entre biomoléculas interrompe as redes de cristal e degrada as propriedades de difracção. A vitrificação é conseguida através de uma combinação de arrefecimento rápido, desidratação e adição de solutos crioprotetores tais como glicerol, etilenoglicol, polietilenoglicóis (PEGs),Álcoois e sais.

A vitrificação limita a cristalização e crescimento do gelo, mas não elimina todo o dano da amostra relacionado ao resfriamento. Por exemplo, a mosaicidade do cristal (uma medida da distribuição das orientações do plano de cristal) aumenta rotineiramente por um fator de 10 a 100 quando os cristais de proteína são arrefecidos em um estado vitrificado ³ e as taxas de sobrevivência pós-descongelamento de espermatozóides e oócitos vitrificados variam amplamente .

Um mecanismo de danos é a contração diferencial do solvente e do material circundante durante o resfriamento ^{3 , 4 , 5} . As concentrações de solvente e soluto de equilíbrio dentro de um cristal, célula ou tecido dependem da temperatura, e o solvente mais o soluto e o material circundante podem se contrair por diferentes quantidades. O resfriamento rápido pode evitar a redistribuição de solvente e soluto antes da vitrificação e contração diferencial Pode levar a tensões grandes, não homogêneas e sem equilíbrio que causam danos à amostra.

As abordagens racionais para reduzir o dano induzido pelo resfriamento podem assim beneficiar do conhecimento das densidades dependentes da temperatura de misturas aquosas líquidas e vitrificadas. Em concentrações de soluto acima de 50% de peso de soluto em peso de solução (p / p), a maioria das misturas de crioprotectores aquosas pode ser vitrificada com taxas de resfriamento moderadas de 10 K / s ou menos, permitindo a produção e medições de densidade usando grandes amostras vítreas ⁶ . A densidade pode então ser determinada usando o princípio de Arquimedes, medindo o peso aparente da amostra quando suspenso em um criógeno líquido como nitrogênio. No entanto, à medida que a concentração de soluto diminui, as taxas de resfriamento necessárias para a vitrificação aumentam rapidamente: as taxas de resfriamento para as misturas aquosas de glicerol aumentam de <10 K / s a ​​50% do peso do soluto em g para o volume de solução em mL (p / v) para> 1.000 K / s a ​​25% p / vAss = "xref"> 7. A transferência de calor torna-se limitada na camada limite, de modo que a obtenção de maiores taxas de resfriamento requer amostras menores e menores ⁸ .

As medições da densidade de água vítrea pura e gelo foram conseguidas através da deposição de diâmetro do micômetro (volume de femtoliter) em um vácuo em uma superfície de refrigeração criogênica, de modo a construir uma amostra macroscópica (massa de grama). A densidade desta amostra foi determinada por crioflotação em uma mistura de nitrogênio-árgon líquido, na qual a densidade do líquido criogênico foi ajustada até a amostra tornar-se neutra ⁹ . No entanto, gerar grandes amostras de um grande número de pequenas gotas de uma maneira que minimiza os volumes vazios – uma importante fonte de erro nas medidas anteriores de densidade de fase vítrea – não é trivial. Para misturas aquosas, a evaporação diferencial dos componentes da solução durante a aerossolização e deposição no vácuo pode levar aIncertezas substanciais nas concentrações depositadas.

Desenvolvemos um método, baseado na crioflotação, que permite a determinação precisa da densidade de misturas aquosas usando gotas individuais tão pequenas quanto 50 pL ¹⁰ . Estas gotas podem ser rapidamente arrefecidas mantendo suas concentrações originais e seu estado de temperatura criogênica (vitrificado ou cristalino) pode ser avaliado usando um ensaio visual simples que se correlaciona com as medidas de difração de raios X. Este método é amplamente aplicável a misturas aquosas e não aquosas e pode ser alargado a uma variedade de amostras biológicas, incluindo células ( por exemplo , caule e ovo), amostras de tecido e cristais de proteínas com densidades de baixa temperatura entre 0,8 e 1,4 g / ML.

Protocol

CUIDADO: Consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Use todas as práticas de segurança adequadas ao usar gases comprimidos, incluindo reguladores e válvulas de controle de gás calibrado e tubos de gás aprovados. O contato com criogênios líquidos pode causar congelamento severo e necrose. Use equipamento de proteção pessoal apropriado (protetor facial, luvas, bata de laboratório, calças de comprimento total, sapatos fechados), todos os quais devem ser impermeá…

Representative Results

As medidas de densidade em T = 77 K para gotas vitrificadas de glicerol aquoso e etilenoglicol versus concentração de crioprotectores são mostradas na Figura 1 A e Figura 1 B , respectivamente, e a mudança correspondente no volume específico entre T = 298 K e 77 K, calculada usando anteriormente Determinada T = 298 K densidades, é mostrado na <strong class="xfig"…

Discussion

O presente aparelho e métodos, desenvolvidos principalmente por estudantes de graduação com acesso limitado a ferramentas e máquinas de construção de instrumentos, no entanto, oferecem medidas de densidade altamente precisas para gotas líquidas individuais tão pequenas quanto 50 pL. Na faixa de concentração próxima e acima de 50% p / p, onde pequenas taxas de arrefecimento são suficientes para obter amostras vitrificadas, as densidades concordam com as obtidas em medidas anteriores em amostras em massa. As e…

Materials

centrifuge tube	Falcon	6029236	15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5%	Sigma	G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8%	Sigma	324558-100 mL
analytical microbalance	Mettler	AE240	Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance
vortexer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing	Unistrut	1-5/8" metal framing	48" wide x 24" deep x 40" tall
Apparatus enclosure air barrier			any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk			4" diameter, 1/8" thick
dewar flask	Scilogix Dilvac	SS333	4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber			This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas	Airgas	NI HP300	99.998% pure N2 gas
argon gas	Airgas	AR HP300	99.998% pure Ar gas
rotameter	Omega	FL3692ST	2.52 l/min max flow rate
foam insulating lid			This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".
PTFE test mass			This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end.
microbalance platform	Unistrut	1-5/8" metal framing	11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line	Berkley	NF1502-CM	Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing	VWR	60985-512	1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer			1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe	BD	309628	1 ml Luer-Lok tip syringe
vacuum generator	Gast	VG-015-00-00	compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray	RainX	620036	plastic water repellent
long focal length stereo microscope	Bausch and Lomb Stereozoom 6		0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance
LED ring illuminator	Amscope	LED144S
LED spot illuminator	Newhouse Lighting	NHCLP-LED	3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial	Nunc	V7634-500EA	Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate