मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल
Summary
मानव मिट्रल वाल्व की प्रोटीन संरचना अभी भी आंशिक रूप से अज्ञात है, क्योंकि इसका विश्लेषण कम सेल्युलैरिटी द्वारा जटिल है और इसलिए कम प्रोटीन बायोसिंथेसिस द्वारा। यह काम मित्राल वाल्व प्रोटीम के विश्लेषण के लिए प्रोटीन को कुशलतापूर्वक निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
सेलुलर प्रोटीम का विश्लेषण जटिल जैविक प्रणालियों में मौजूद प्रोटीनों की बड़े पैमाने पर पहचान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देने वाले प्रौद्योगिकियों के विकास के कारण होने वाली बीमारियों के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। एक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण से प्राप्त ज्ञान संभावित रूप से एक रोगों के अंतर्निहित रोगजनक तंत्रों की बेहतर समझ, उपन्यास नैदानिक और भविष्यवाणी रोग मार्करों की पहचान के लिए, और उम्मीद है कि, चिकित्सीय लक्ष्य। हालांकि, हृदयात्मक मिट्रल वाल्व प्रोटियोपॉलिकैन और कोलेजन-समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स में कम सेल्युलैरिटी के कारण प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक बहुत चुनौतीपूर्ण नमूना का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक वैश्विक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन निकालने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो बाद के प्रोटीन विश्लेषण के साथ संगत है, जैसे मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और इम्यूनोब्लॉटिंग। यह डेटा चिंता के संबंध के लिए अनुमति दे सकता हैमात्रात्मक एमआरएनए अभिव्यक्ति और गैर-मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण पर डेटा के साथ जी प्रोटीन अभिव्यक्ति। दरअसल, इन तरीकों, जब एक साथ प्रदर्शन किया जाता है, तो एमआरएनए से पोस्ट-ट्रांसलेशन प्रोटीन संशोधनों से, आणविक तंत्रों के अंतर्निहित रोगों की एक अधिक व्यापक समझ प्राप्त करेगा। इस प्रकार, यह विधि कार्डियक वाल्व फिजियोपैथोलॉजी के अध्ययन में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक हो सकती है।
Introduction
हाल के सबूतों में एमआरएनए संश्लेषण के बाद होने वाली कई नियामक तंत्रों की भूमिका की समझ में बदलाव आया है। दरअसल, अनुवाद, पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल, और प्रोटीयोलायटिक प्रोसेस प्रोटीन बहुतायत और कार्य को विनियमित कर सकते हैं। हठधर्मिता – जो कहती है कि एमआरएनए सांद्रता संबंधित प्रोटीनों के लिए प्रॉक्सी हैं, यह मानते हुए कि ट्रांस्क्रिप्ट स्तर प्रोटीन बहुतायत का मुख्य निर्धारक हैं – आंशिक रूप से संशोधित किया गया है। वास्तव में, प्रतिलेख स्तर केवल प्रोटीन की प्रचुरता का आंशिक रूप से अनुमान लगाता है, जो कि पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल इवेंट्स कोशिकाओं 1 , 2 के भीतर प्रोटीन को विनियमित करने के लिए होते हैं
इसके अलावा, प्रोटीन अंततः सेल के कार्य को नियंत्रित करता है और इसलिए अपने फ़िनोटाइप को नियंत्रित करता है, जो ऑटोक्राइन, पैराकाइन और अंतःस्रावी कारकों के जवाब में गतिशील परिवर्तन कर सकता है; रक्तजनित मध्यस्थों; तापमान; दवा से इलाज; और रोग का विकासजाहिर। इस प्रकार, प्रोटीन स्तर पर केंद्रित एक अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रोटीम को चिह्नित करने और बीमारी रोगजनन 3 के भाग के रूप में होने वाले महत्वपूर्ण बदलावों को उजागर करने के लिए उपयोगी है।
इसलिए, मौजूदा तकनीकी चुनौतियों के बावजूद स्वास्थ्य और रोग की स्थितियों को स्पष्ट करने के लिए मौजूद प्रोटीओमिक्स मौजूद हैं। अनुसंधान के विशेष रूप से होनहार क्षेत्रों, जिनके लिए प्रोटिओमिक्स योगदान कर सकते हैं: किसी भी स्तर पर बदलकर प्रोटीन अभिव्यक्ति की पहचान ( यानी पूरे कोशिकाओं या ऊतक, subcellular डिब्बों, और जैविक तरल पदार्थ); रोग के निदान और रोग का निदान के लिए उपयोगी उपन्यास बायोमार्कर की पहचान, सत्यापन, और सत्यापन; और, उम्मीद है, नए प्रोटीन लक्ष्य की पहचान जो चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए 4 ।
की जटिलता पर कब्जाप्रोटीम एक तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है वर्तमान प्रोटिओमिक टूल, प्रोटीन के स्तरों की पहचान, मात्रा का ठहराव और सत्यापन के लिए बड़े पैमाने पर, उच्च-थ्रुपुट विश्लेषण का प्रदर्शन करने का अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, फॉक्साशन और संवर्धन तकनीकों का परिचय, जो कि प्रचुर मात्रा में प्रोटीनों की वजह से हस्तक्षेप से बचने के उद्देश्य से कम से कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीनों को शामिल करके प्रोटीन की पहचान में सुधार लाया है। अंत में, प्रोटिओमिक्स को पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों के विश्लेषण द्वारा पूरित किया गया है, जो प्रोटीन फ़ंक्शन के उत्तरोत्तर महत्वपूर्ण modulators के रूप में उभरते हैं।
हालांकि, विश्लेषण के तहत जैविक नमूनों में नमूना तैयार करने और प्रोटीन की वसूली अभी भी प्रोटिओमिक वर्कफ़्लो में सीमित कदम बनी रहती है और संभावित नुकसान 5 की संभावना बढ़ाती है। वास्तव में, अधिकांश आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में जो अनुकूलित किया जाना चाहिए, पहले चरण ऊतक होमोजीजिएट हैंआयन और सेल विश्लेषण, विशेष रूप से कम प्रचलीता प्रोटीन के विश्लेषण के दौरान, जिसके लिए प्रवर्धन विधि मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, प्रोटीन की रासायनिक प्रकृति अपने स्वयं के वसूली को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, अत्यधिक हाइड्रोफोबिक प्रोटीन का विश्लेषण बहुत ही चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि वे आसानी से आइसोइक्ट्रिक के दौरान ध्यान केंद्रित करते हैं, जबकि ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन लगभग अघुलनशील हैं (संदर्भ 5 में समीक्षा की गई)। इसके अलावा, ऊतक रचना परिवर्तनशीलता सार्वभौमिक निकासी विधि को विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा पैदा करती है। अंत में, क्योंकि लगभग सभी नैदानिक नमूने सीमित मात्रा के हैं, कम से कम नमूना मात्रा 6 से अधिकतम वसूली और प्रजनन क्षमता के साथ प्रोटीन की तैयारी को सक्षम करना आवश्यक है।
यह काम सामान्य मानव कार्डियक मिट्रल वाल्व से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक बहुत चुनौतीपूर्ण नमूना का प्रतिनिधित्व करता है। सामान्य मैट्रल वाल्व एक COMP हैबाएं आलिंद और दिल के बाएं वेंट्रिकल के बीच झूठ बोलने वाला लेक्स संरचना ( चित्रा 1 )। यह एट्रियम से रक्त प्रवाह के नियंत्रण में वेंट्रिकल के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बैकफ्लो को रोकने और पूरे शरीर को ऑक्सीजन की आपूर्ति का उचित स्तर सुनिश्चित करता है, इस प्रकार एक पर्याप्त कार्डियक आउटपुट बनाए रखता है हालांकि, यह आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स में कम सेल्युलैरिटी और कुछ घटकों के साथ "निष्क्रिय" ऊतक माना जाता है। इसका कारण यह है, सामान्य परिस्थितियों में, निवासी वाल्व्युलर इन्स्ट्रिसियल सेल (वीआईसी) कम प्रोटीन बायोसिंथेसिस दर 7 के साथ एक मौनसंपादित करें।
हालांकि, यह दिखाया गया है कि, एक रोगशास्त्रीय स्थिति में, स्पन्गॉआसा में वीआईसी की संख्या बढ़ जाती है और उनके प्रोटीन संश्लेषण सक्रिय होते हैं, साथ में अन्य कार्यात्मक और फेनोटिकल बदलाव 8 । इसलिए, यह आश्चर्यजनक नहीं है कि न्यूनतम डेटा उपलब्ध हैसाहित्यिक रोगी वाल्व 9 , 10 के विश्लेषण पर साहित्य का ध्यान केंद्रित किया गया है , जिसमें सक्रिय वीआईसी की संख्या बढ़ी हुई प्रोटीनों की अपेक्षाकृत उच्च संख्या की व्याख्या कर सकती है।
निष्कर्ष में, वर्तमान प्रोटोकॉल मिथ्रल वाल्व प्रोटीन घटकों के अध्ययन के माध्यम से विकृति रोगों के लिए जिम्मेदार रोगजनक तंत्र की समझ विकसित करने के लिए काम कर सकता है। दरअसल, अंतर्निहित रोग प्रक्रियाओं की एक बड़ी समझ से वाल्व रोगों के नैदानिक प्रबंधन में सुधार करने में मदद मिल सकती है, जिनके मौजूदा हस्तक्षेप के संकेतों को मोटे तौर पर हेमोडायनामिक विचारों पर माना जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम नमूना फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग और चक्की प्रणाली को ठंडा करने के लिए है। तरल नाइट्रोजन का उपयोग जैविक गिरावट को रोकता है और कुशल पाउडरिंग के लिए अनुमति …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय ने इस अध्ययन का समर्थन किया (आर सी 2013-जैव 15)। हम उत्कृष्ट उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बारबरा मिशेली का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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