מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק
Summary
ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.
Abstract
ננו-חלקיק Upconversion (UCNP)-photoactivation בתיווך היא גישה חדשה מרחוק שליטה bioeffectors עם הרבה פחות phototoxicity ועם חדירה לרקמות עמוקות יותר. עם זאת, המכשור הקיים בשוק אינה תואמת ברצון upconversion היישום. לכן, שינוי זמין מסחרית לכלי חיוני עבור מחקר זה. בנייר זה, אנו קודם ממחישים את השינויים של fluorimeter קונבנציונלי ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי להפוך אותם תואם לניסויים upconversion פוטון. לאחר מכן נתאר את הסינתזה של-סגול (ניר)-עוררה בכלובים קינאז A קטליטי יחידת משנה של חלבונים (PKA) ותשמרו על מתחם UCNP. פרמטרים עבור microinjection ונהלים photoactivation ניר מדווחים גם. לאחר בכלוב PKA-UCNP הוא microinjected לתוך תאי פיברובלסט REF52, ההקרנות ניר, אשר עדיפה משמעותית על-קונבנציונאלי הקרנת UV, מפעיל ביעילות מסלול התמרה חושית אות PKA בתאים חיים. בנוסף, ניסויים בקרה חיובית ושלילית לאשר כי מסלול PKA-induced שמוביל התפוררות של סיבי סטרס המופעלת באופן ספציפי על-ידי ניר הקרנה. לפיכך, השימוש של חלבון-השתנה UCNP מספק גישה חדשנית לשלוט מרחוק מאופנן אור הסלולר ניסויים, שבה יש להימנע חשיפה ישירה לאור UV.
Introduction
חלבונים ששונו כימית זה יכול להיות photoactivated (למשל, חלבונים PKA בכלוב) פותחו כשדה המתעוררים בביולוגיה כימי לטיפול לא פולשני תהליכים ביוכימיים המערכת1,2 ,3. באמצעות אור כמו גירוי מספק רזולוציה מעולה ייתכן בעת הפעלת אלה בכלוב חלבונים. אולם אור UV יכולה לגרום שינויים מורפולוגיים רצויה אפופטוזיס, נזק לדנ א תאים4,5. לפיכך, ההתפתחויות האחרונות בעיצוב של קבוצות photocaging מתמקדים הפעלת photocleavage על עירור הגל או שני הפוטונים כדי להפחית את phototoxicity, כמו גם כדי להגביר את רקמות עמוק חדירה6,7. קבוצות שכולאת המגיבות אורך גל ארוך יותר המאפשר לנו לבחור מתאימים אורכי של uncaging גל (קרי, ערוצי) באופן סלקטיבי להפעיל bioeffectors כאשר שני או יותר קבוצות caging נוכח7. בהינתן התכונות השימושיות הבאות, פיתוח קבוצות חדשות photocaging האורות האדומים היא עבודה מאד חשובה במעלה הזרם של מתודולוגיות פוטו אטמוספרי מחקרים ביולוגיים החל בודק את המנגנון של תגובות לשליטה פעילות הסלולר8. בכל זאת, קבוצת caging שני הפוטונים הוא בדרך כלל גם הידרופוביות בזכות מבנה הטבעת הארומטית מאוחה, קבוצה caging האור הוא בדרך כלל אורגנומתכתית, עם ליגנדים ארומטי. מאפיין זה הידרופובי/ארומטי אינה מתאימה כאשר bioeffector הוא חלבון או אנזים, כפי שהוא denatures באתר האקטיבציה של החלבון/האנזים גורם לאובדן של הפונקציה, אפילו אם ההטיה ואת פוטוליזה עדיין עובד ברמה הכימית2 ,9.
UCNPs הם מתמרים יעיל זה להמיר את האור עירור ניר UV. מאפיין זה ייחודי ומרתק של UCNPs הציע רזולוציות מציאותי להתייחס לאתגרים הקשורים photoactivation ועורר שחרור מבוקר של מולקולות קטנות, כולל חומצה פולית10, ציספלטין נגזרים11 , DNA/siRNA12קופולימר שלפוחית13, חלקיקים חלול14. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, photoactivation UCNP בסיוע של אנזימים או חלבונים לא נבדקו עד כה. כי אין שום תיק מוצלח של שימוש באור אדום או ניר photoactive אנזים, לנו היו מתבקש לבצע את ההפעלה המופעלות ניר של מבנה חלבון/אנזים מורכב מתחמי ששונו כימית אנזים בכלוב עם סיליקה מצופים, לנתניד מסטול UCNP15. במחקר זה, היה UCNP מצומדת עם קינאז התמרה חושית מגיבים במהירות האות בצורה של PKA בכלובים. PKA שולט סינתזה הגליקוגן ורגולציה cytoskeletal המגיבה לגירויים חיצוניים באמצעות מחזורית אדנוזין פוספט (מחנה) תקנה ציטוזול16. למדנו את הכדאיות של הפעלת אנזים נימוסים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית בניסוי הסלולר לאחר הקרנה ניר. פלטפורמה זו בסיוע UCNP photoactivation הוא מתודולוגיה חדשה photoactivate אנזים באמצעות ניר ומונעת את התגובה התמרה חושית אות בלתי רצויה מתאי הנגרמת על ידי קונבנציונאלי UV הקרנה2,4.
. זה קשה מאוד translocate גדול bioeffectors (למשל, חלבונים) על פני קרום התא כדי לשלוט פעילות תאית. למרות חלבון חלקיקים. מרותק למיטה עשוי להיות קל יותר translocate באמצעות אנדוציטוזה לתוך ציטוזול, ייתכן אנדוציטוזה פגום או מושפל באמצעות מלכודת endosomal ו-2,את הסוגר השפלה lysosomal4. גם אם החלבון בכלוב הוא עדיין מתפקד לאחר רוברטסונית ממברנה, הכמויות translocated אולי לא יהיה מספיק כדי לעורר תגובת תאי ה-2,17 בניגוד חריף, microinjection היא גישה ישירה ולא כמותיים כדי לספק bioeffectors גדולים אל הציטופלסמה של התא. יתר על כן, bioeffector UCNP. מרותק למיטה דורש אור upconverted להיות מופעל. לכן, מכשור אופטי דורש שינוי כדי למדוד באופן חזותי, לנצל את האור upconversion. בעבודה זאת, המסירה של מתחם PKA-UCNP בכלובים לתא באמצעות microinjection ו חיוניים ספקטרוסקופיה ו מיקרוסקופ השינויים הבאים עבור ניר photoactivation יתוארו בפרוטרוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, הופמן ועמיתים מצא כי שינויים מורפולוגיים דרמטי נצפו בתאים REF52 לאחר microinjection של PKA חופשי19. במחקר אחר, קבוצת לורנס הוכיח כי PKA בכלוב יכול להיות מופעל ויוו, המוביל שינויים מורפולוגיים התפוררות של סיבי סטרס כאשר נתון UV פוטוליזה20. מוקדם יותר דיווח על ניצול אור …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המדע ננו טכנולוגיה תוכנית של אקדמיה Sinica, משרד המדע ואת הטכנולוגיה של טייוואן לצורך מימון (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
