Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation
Summary
In dit protocol was gekooide proteïne kinase A (PKA), een Cellulaire signaaltransductie bioeffector, geïmmobiliseerd op een oppervlak van nanoparticle, microinjected in het cytosol en geactiveerd door de upconverted UV-licht van nabij-infrarood (NIR) bestraling, inducerende stroomafwaarts stress vezel desintegratie in het cytosol.
Abstract
Upconversion nanoparticle (UCNP)-gemedieerde photoactivation is een nieuwe aanpak om op afstand controle bioeffectors met veel minder fototoxiciteit en diepere weefsels penetratie. De bestaande instrumenten op de markt is echter niet gemakkelijk compatibel met upconversion toepassing. Wijzigen van de commercieel beschikbare instrument is daarom essentieel voor dit onderzoek. In deze paper illustreren we eerst de wijzigingen in een conventionele fluorimeter en fluorescentie Microscoop te laten compatibel voor foton upconversion experimenten. Vervolgens beschrijven we de synthese van een nabij-infrarood (NIR)-geactiveerd gekooide proteïne kinase A katalytische subeenheid (PKA) geïmmobiliseerd op een UCNP complex. Parameters voor microinjection en NIR photoactivation procedures worden ook gemeld. Nadat de gekooide PKA-UCNP is microinjected in REF52 fibroblast cellen, activeert de bestraling van het NIR, dat aanzienlijk superieur aan conventionele UV-bestraling is, efficiënt de PKA signaaltransductie traject in levende cellen. Bovendien bevestigen de positieve en negatieve controle experimenten dat de PKA-geïnduceerde traject leidt tot het uiteenvallen van stress vezels specifiek wordt geactiveerd door NIR bestraling. Het gebruik van gemodificeerde eiwitten UCNP biedt dus een innovatieve benadering van op afstand bedienen licht-gemoduleerd cellulaire experimenten, waarin directe blootstelling aan UV-licht vermeden worden moet.
Introduction
Chemisch gemodificeerde eiwitten die photoactivated (bijvoorbeeld PKA gekooide eiwitten worden kunnen) zijn ontwikkeld als een opkomende veld in de chemische biologie te niet-gebeurt manipuleren intercellulaire biochemische processen1,2 ,3. Met behulp van licht, zoals een stimulans uitstekende Spatio resolutie biedt bij het activeren van deze gekooide eiwitten. UV-licht kan echter leiden tot ongewenste morfologische veranderingen, apoptosis en DNA schade aan cellen4,5. Vandaar, recente ontwikkelingen in het ontwerp van photocaging groepen richten over het inschakelen van photocleavage bij langere golflengte of twee-foton excitatie om fototoxiciteit, evenals over het verhogen van de diep-weefsel penetratie6,7. Kooien groepen die reageren op langere golflengte waardoor ons om te kiezen van de geschikte uncaging golflengten (d.w.z., kanalen) selectief activeren bioeffectors wanneer twee of meer caging groepen zijn huidige7. Gezien deze handige functies, is ontwikkeling van nieuwe rood-licht photocaging groepen zeer belangrijk stroomopwaartse werk in fotochemische methodologieën voor biologische studies, variërend van het sonderen van de mechanismen van de reacties op het beheersen van cellulaire activiteiten8. Niettemin, een twee-foton caging groep is normaal als gevolg van de structuur van de gesmolten aromatische ring te hydrophobic, en een caging groep van zichtbaar licht is normaal organometaal, met aromatische liganden. Deze hydrofobe/aromatische eigenschap is niet geschikt als de bioeffector is een eiwit of enzym, zoals het denatureert van de site van de activering van het enzym/eiwit en verlies van functie, veroorzaakt zelfs als de vervoeging en fotolyse nog steeds op de chemische niveau2 werkt ,9.
UCNPs zijn effectieve omvormers die het NIR excitatie licht omzetten in UV. Deze unieke en fascinerende eigenschap van UCNPs biedt realistische oplossingen voor de uitdagingen in verband met photoactivation en geactiveerd gecontroleerde afgifte van kleine molecules, met inbegrip van foliumzuur10, cisplatine derivaten11 , DNA/siRNA12, copolymeer blaasjes13en holle deeltjes14. Echter tot de beste van onze kennis, is de UCNP-bijgewoonde photoactivation van enzymen of eiwitten niet getest tot nu toe. Omdat er geen succesvolle geldt voor het gebruik van rood licht of NIR photoactive een enzym, werden we gevraagd uit te voeren van de NIR-geactiveerd activering van een eiwit/enzym constructie bestaat uit chemisch gewijzigde gekooide enzym complexen met een silica-bekleed, lanthanide-doped UCNP15. In dit onderzoek was de UCNP met een snel reagerende signaaltransductie kinase in de vorm van gekooide PKA vervoegd. PKA regelt glycogeen-synthese en cytoskeletal verordening die op externe prikkels via cyclisch adenosine fosfaat (cAMP) verordening in het cytosol16 reageert. We studeerde de haalbaarheid van enzymactivering in temporele en ruimtelijke manieren in een cellulaire experiment na NIR bestraling. Dit UCNP-bijgewoonde photoactivation platform is een nieuwe methode om photoactivate een enzym met behulp van NIR en vermijdt de ongewenste signaaltransductie reactie van cellen veroorzaakt door conventionele UV-bestraling-2,4.
Het is zeer moeilijk te translocate grote bioeffectors (bijvoorbeeld eiwitten) tussen de celmembranen controle van cellulaire activiteit. Hoewel deeltje-geïmmobiliseerd eiwit gemakkelijker translocate via endocytose in het cytosol wellicht, kan endocytose worden beschadigd of gedegradeerd via endosomal entrapment en de daaruit voortvloeiende lysosomale afbraak2,4. Misschien zelfs als de gekooide proteïne nog steeds functioneel na membraan translocatie is, de translocated bedragen niet genoeg om het activeren van de cellulaire reactie2,17. In schril contrast is microinjection een directe en kwantitatieve benadering leveren grote bioeffectors naar het cytoplasma van de cel. Bovendien vereist de bioeffector UCNP-geïmmobiliseerd upconverted licht te worden geactiveerd. De optische instrumenten vereist daarom verdere wijziging te meten, visualiseren, en gebruik maken van het licht upconversion. In dit werk, zal de levering van een gekooide PKA-UCNP-complex naar een cel met behulp van microinjection en de volgende essentiële spectroscopie en microscopie wijzigingen voor NIR photoactivation in detail worden beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerder, Hofmann en collega’s vinden dat dramatische morfologische veranderingen werden waargenomen in de REF52 cellen na de microinjection van de gratis PKA-19. In een andere studie, de groep Lawrence aangetoond dat gekooide PKA geactiveerd in vivo worden kan, wat leidt tot morfologische veranderingen en het uiteenvallen van stress vezels wanneer onderworpen aan UV fotolyse20. Eerder verslagen over het benutten van upconverted UV licht voor photoactivation toonde d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Nano-wetenschap en technologie programma van de Academia Sinica en het ministerie van wetenschap en technologie van Taiwan voor de financiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
