Ein integriertes System aus der Ferne intrazelluläre Signaltransduktion von Großbildschirmen Nanoparticle vermittelte Kinase Photoaktivierungen auslösen
Summary
In diesem Protokoll eingesperrte Proteinkinase A (PKA), ein zelluläres Signal Transduction Bioeffector, war auf einem Nanoparticle Oberfläche immobilisiert, mikroinjiziert in das Zytosol und aktiviert, indem die hochkonvertiert UV-Licht von Nah-Infrarot (NIR) Bestrahlung, Induktion nachgeschalteten Stress Faser Zerfall in das Zytosol.
Abstract
Großbildschirmen-Nanopartikel (UCNP)-vermittelten Photoaktivierungen ist ein neuer Ansatz für Remote Control BIOeffektoren mit viel weniger Phototoxizität und tiefere Gewebe eindringen. Die bestehenden Instrumente auf dem Markt ist jedoch nicht ohne weiteres kompatibel mit Großbildschirmen Anwendung. Daher ist es wichtig für diese Forschung, das kommerziell erhältliche Instrument ändern. In diesem Beitrag zeigen wir zuerst die Änderungen eines konventionellen Fluorimeter und Fluoreszenzmikroskop, um sie kompatibel für Photon Großbildschirmen Experimente zu machen. Dann beschreiben wir die Synthese von einem nahen Infrarot (NIR)-Käfig Protein Kinase A katalytische Untereinheit (PKA) auf einem UCNP Komplex immobilisiert ausgelöst. Parameter für die Mikroinjektion und NIR Photoaktivierungen Verfahren werden auch gemeldet. Nachdem die eingesperrte PKA-UCNP in REF52 Fibroblastenzellen mikroinjiziert ist, löst die NIR-Bestrahlung, die herkömmlichen UV-Bestrahlung deutlich überlegen ist, effizient die PKA Transduktion Signalweg in lebenden Zellen. Positive und negative Kontrolle Experimente bestätigen darüber hinaus, dass die PKA-induzierten Weg zur Auflösung von Stress Fasern speziell von NIR Bestrahlung ausgelöst wird. So bietet der Einsatz von Protein-modifizierte UCNP einen innovativen Ansatz zur Fernsteuerung Licht moduliert zellulärer Experimenten, in denen direkte Einwirkung von UV-Licht vermieden werden muss.
Introduction
Chemisch modifizierte Proteine, die photoaktiviert (z. B. PKA eingesperrt Proteine) ist entstanden als ein aufstrebendes Gebiet in der chemischen Biologie, nicht-invasiv interzelluläre biochemische Prozesse1,2 manipulieren ,3. Mit Licht, wie ein Stimulus ausgezeichnete räumlich-zeitliche Auflösung bietet, wenn Sie diese aktivieren im Käfig Proteine. UV-Licht kann jedoch unerwünschte morphologische Veränderungen, Apoptose und DNA-Schäden an Zellen4,5führen. Daher konzentrieren sich jüngste Entwicklungen in der Gestaltung von Photocaging Gruppen über die Aktivierung der Photocleavage auf längeren Wellenlänge oder zwei-Photon Erregung Phototoxizität, sowie Verringerung der tiefen Gewebe eindringen6,7zu erhöhen. Festsetzende Gruppen, die auf längeren Wellenlänge ermöglicht es uns, geeignete uncaging Wellenlängen (z.B.Kanäle) wählen gezielt zu reagieren aktivieren BIOeffektoren, wenn zwei oder mehr festsetzende Gruppen sind vorhanden-7. Angesichts dieser nützlichen Funktionen, ist entwickeln neue Rotlicht-Photocaging Gruppen sehr wichtig vorgelagerten Werk in photochemischen Methoden für biologische Studien von sondieren die Mechanismen der Reaktionen auf die Kontrolle der zellulären Aktivitäten8. Nichtsdestotrotz eine zwei-Photonen-festsetzende-Gruppe ist in der Regel auch hydrophobe aufgrund der verschmolzenen aromatischen Ring-Struktur und eine sichtbaren Lichts festsetzende Gruppe ist normalerweise organometallischen, mit aromatischen Liganden. Diese hydrophoben/aromatisch-Eigenschaft ist nicht geeignet, wenn die Bioeffector ein Protein oder Enzym, ist, wie es Ortsbild Aktivierung des Enzyms/Protein denaturiert und führt zum Verlust der Funktion, auch wenn die Konjugation und Photolyse noch auf chemischer Ebene2 arbeiten ,9.
UCNPs sind effektive Wandler, die das Anregungslicht NIR bis UV umwandeln. Diese einzigartige und faszinierende Eigenschaft der UCNPs bietet realistische Lösungen für die Herausforderungen im Zusammenhang mit Photoaktivierungen und kontrollierten Freisetzung von kleinen Molekülen, darunter Folsäure10, Cisplatin Derivate11 ausgelöst , DNA/SiRNA12, Copolymer Vesikel13und hohle Partikel14. Jedoch wurde nach bestem Wissen und Gewissen, die UCNP-gestützte Photoaktivierungen Enzyme oder Proteine nicht bisher getestet. Da gibt es keine erfolgreichen Fall mit Rotlicht oder NIR photoaktiven ein Enzym, wurden wir aufgefordert, die NIR-ausgelösten Aktivierung ein Protein/Enzym-Konstrukt bestehend aus chemisch modifizierte Käfighaltung Enzymkomplexe mit einer Silica-beschichtete durchführen, Lanthanid-dotierte UCNP15. In dieser Studie wurde die UCNP mit einem schnell reagierenden Signaltransduktion Kinase in Form der Käfighaltung PKA konjugiert. PKA steuert Glykogen-Synthese und Zytoskeletts Verordnung, die auf äußere Reize über zyklische Adenosin Phosphat (cAMP) Verordnung im Zytosol16reagiert. Wir untersuchten die Machbarkeit der Enzym-Aktivierung in zeitlicher und räumlicher Manieren in einem zellulären Experiment nach NIR Bestrahlung. Diese UCNP-gestützte Photoaktivierungen-Plattform ist eine neue Methode zur Photoactivate ein Enzym mit NIR und vermeidet unerwünschte Signal Transduction Resonanz Zellen verursacht durch konventionelle UV Bestrahlung2,4.
Es ist sehr schwierig, große BIOeffektoren zu translozieren (z. B. Proteine) in der Zellmembran, Zellaktivität zu kontrollieren. Obwohl Partikel immobilisiert Protein leichter über Endozytose in das Zytosol translozieren sein kann, kann Endozytose beschädigt oder über Endosomal Einschluss und die daraus resultierenden lysosomalen Abbau2,4abgebaut. Selbst wenn das eingesperrte Protein nach Membran Translokation noch funktionsfähig ist, möglicherweise translozierten Beträge nicht ausreichen, um die zelluläre Reaktion2,17auslösen. In scharfem Kontrast ist Mikroinjektion eine direkte und quantitativen Ansatz, große Bioeffectors an das Zytoplasma der Zelle zu liefern. Darüber hinaus erfordert UCNP immobilisiert Bioeffector hochkonvertiert Licht aktiviert werden. Die optische Messtechnik erfordert daher weitere Modifikation zu messen, visualisieren und Großbildschirmen Licht zu nutzen. In dieser Arbeit wird die Lieferung von einem Käfig PKA-UCNP-Komplex zu einer Zelle mit Mikroinjektion und die folgenden wesentlichen Änderungen der Spektroskopie und Mikroskopie für NIR Photoaktivierungen ausführlich beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zuvor, Hofmann und Kollegen zufolge dramatische morphologische Veränderungen nach der Mikroinjektion des freien PKA19REF52 Zellen beobachtet wurden. In einer anderen Studie die Lawrence-Gruppe gezeigt, dass eingesperrte PKA aktiviert in Vivo, kann führt zu morphologischen Veränderungen und den Zerfall der Stress Fasern bei UV-Photolyse20. Früher berichtet über Ausbeutung hochkonvertiert UV-Licht zur Photoaktivierungen zeigten die Aktivierung der verschiedenen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Nano-Wissenschaft und Technologie-Programm der Academia Sinica und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan für die Finanzierung (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
