使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案
Summary
CRISPR相关蛋白Cpf1可以由专门设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，以在所需位点切割双链DNA，产生粘性末端。基于此特点，建立了DNA组装标准（C-Brick），并详细介绍了其使用方法。
Abstract
CRISPR相关蛋白Cpf1在CRISPR RNA（crRNA）的指导下切割双链DNA，产生粘性末端。由于这个特点，Cpf1已被用于建立称为C-Brick的DNA装配标准，其具有长识别位点和短瘢痕的优点。在标准C-Brick载体上，有四个Cpf1识别位点 – 前缀（T1和T2位点）和后缀（T3和T4位点） – 侧翼生物DNA部分。 T2和T3位点的切割产生互补的粘性末端，这允许用T2和T3位点组装DNA部分。同时，组装后部件之间产生短暂的“GGATCC”疤痕。由于新形成的质粒再次含有四个Cpf1切割位点，所以该方法允许DNA部分的迭代装配，这与BioBrick和BglBrick标准相似。概述使用C-Brick标准来组装DNA部分的程序在这里描述。 C-Brick标准可以被科学家，研究生和本科生甚至业余爱好者广泛使用。
Introduction
DNA生物部件的标准化对合成生物学的发展至关重要1 。 DNA组装过程的发展可以取代特设实验设计，并消除在遗传组分装配到更大系统中时出现的许多意想不到的结果。 BioBrick标准（BBF RFC 10）是最早提出的DNA装配标准之一。它使用前缀序列（含有EcoRI和XbaI切割位点）和后缀序列（含SpeI和PstI切割位点） 2,3 。由于XbaI和SpeI具有互补性，所以用XbaI和SpeI切割的BioBrick DNA部件可以连接在一起，生成一个新的BioBrick，用于进一步的迭代装配。
已经使用BioBrick标准鉴定了一些缺陷4 。例如，它产生8-bp的瘢痕在DNA部分之间，其不允许构建融合蛋白。此外，上述四种类型的6-bp限制性位点必须从DNA部分中去除，这是非常不方便的。 BglBrick标准是为了解决第一个问题而建立的。它产生6-bp“GGATCT”瘢痕，产生Gly-Ser并允许多个蛋白质或蛋白质结构域的融合。 iBrick被开发来处理第二个问题6 。它使用识别长DNA序列的归巢内切核酸酶（HE）。由于HE识别位点在天然DNA序列中很少存在，所以iBrick标准可用于直接构建iBrick部分而不修改其DNA序列。然而，iBrick标准在DNA部分之间留下了21bp的瘢痕，这可能是其不受欢迎的原因。
近年来，群集定期交织的短回文重复序列（CRISPR）系统发展迅速7,8 。在CRISPR相关（Cas）蛋白中，来自化脓性链球菌的 Cas9核酸内切酶现在被广泛使用。它主要引入具有钝端的双链DNA断裂（DSB） 9 。
2015年，张和同事首次以Cpf1（来自Prevotella和Francisella 1的CRISPR）为特征。属于2类V型CRISPR-Cas系统，是CRISRP RNA（crRNA）引导型核酸内切酶10 。与Cas9不同，Cpf1引入了具有4或5 nt 5'突出端的DSB 10 。基于此特征，Cpf1用于开发DNA组装标准C-Brick 4 。在C-Brick标准载体上，四个具有前缀T1 / T2和后缀T3 / T4的Cpf1靶位点位于生物部位的侧面;这与BioBrick标准相似。随着T2和T3位点的切割p导致互补的粘性末端，可以在部件之间产生“GGATCC”疤痕的同时执行DNA部件的迭代装配。值得注意的是，C-Brick标准有两个主要优点：识别长目标序列并留下短疤痕。由C-Brick产生的6bp“GGATCC”瘢痕编码Gly-Ser，其允许构建融合蛋白。此外，C-Brick标准也与BglBrick和BioBrick标准部分兼容。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了DNA组装标准C-Brick的程序。该协议中最重要的一步是C-Brick标准向量的线性化;载体的不完全切割可能严重影响成功率。另外，虽然Cpf1主要以“18-23”切割模式切割目标DNA序列，但也检测到两个碱基附近的不准确的切割，这可能在DNA组装后引起少量突变。因此，需要Sanger测序来验证组装的构建体。
C-Brick组件的效率低于以前研究中已经描述的传统限制酶和连接方法<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢上海托洛生物科技在开发C-Brick标准方面的技术援助。这项工作得到了中国科学院战略重点研究计划（批准号：XDB19040200）的资助。
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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