Protocollen voor C-Brick DNA Standard Assembly met behulp van Cpf1
Summary
CRISPR-geassocieerd eiwit Cpf1 kan geleid worden door een speciaal ontworpen CRISPR RNA (crRNA) om dubbelstrengs DNA op gewenste plaatsen te kloppen, waardoor kleverige einden worden geproduceerd. Op basis van dit kenmerk werd een DNA-assemblage standaard (C-Brick) opgericht, en hier wordt een protocol beschreven waarin het gebruik ervan wordt beschreven.
Abstract
CRISPR-geassocieerd eiwit Cpf1 splitst dubbelstrengs DNA onder leiding van CRISPR RNA (crRNA), waardoor kleverige einden worden geproduceerd. Vanwege deze eigenschap is Cpf1 gebruikt voor de oprichting van een DNA-assemblage standaard genaamd C-Brick, die het voordeel heeft van lange herkenningsplaatsen en korte littekens. Op een standaard C-Brick vector zijn er vier Cpf1 herkenningssites – de prefix (T1 en T2 sites) en het achtervoegsel (T3 en T4 sites) – flankerende biologische DNA-onderdelen. De splitsing van T2- en T3-plaatsen produceert complementaire kleverige uiteinden, die het mogelijk maken om de DNA-delen samen te stellen met T2- en T3-plaatsen. Ondertussen wordt een kort "GGATCC" litteken gevormd tussen onderdelen na montage. Aangezien het nieuw gevormde plasmide opnieuw de vier Cpfl-splitsingsplaatsen bevat, maakt de werkwijze het iteratieve samenstellen van DNA-delen mogelijk, die vergelijkbaar is met die van BioBrick en BglBrick-normen. Een procedure waarin het gebruik van de C-Brick-standaard wordt beschreven om DNA-onderdelen te assemblerenWordt hier beschreven. De C-Brick-standaard kan veel gebruikt worden door wetenschappers, afgestudeerden en studenten en zelfs amateurs.
Introduction
De standaardisatie van biologische delen van DNA is belangrijk voor de ontwikkeling van synthetische biologie 1 . De ontwikkeling van een DNA-assemblageprocedure kan ad hoc experimentele ontwerpen vervangen en veel van de onverwachte uitkomsten die zich voordoen tijdens de assemblage van genetische componenten in grotere systemen verwijderen. De BioBrick-standaard (BBF RFC 10) was een van de vroegste voorgestelde DNA-montagestandaarden. Het maakt gebruik van de prefix-sequentie (die EcoRI- en XbaI-snijsites bevat) en de achtervoegingsreeks (die SpeI- en PstI-snijsites) 2 , 3 bevatten . Omdat XbaI en SpeI complementaire samenhangende uiteinden hebben, kunnen BioBrick DNA-delen die met XbaI en SpeI worden gesneden, worden samengevoegd en een nieuwe BioBrick genereren voor verdere iteratieve montage.
Enkele gebreken zijn geïdentificeerd met behulp van de BioBrick standaard 4 . Bijvoorbeeld, het produceert een 8-bp littekenTussen de DNA-delen, die niet toelaat voor de constructie van in-fusie-eiwitten. Daarnaast moeten de vier bovengenoemde typen van 6-bp restrictieplaatsen verwijderd worden van de DNA-delen, wat erg ongemakkelijk is. De BglBrick standaard werd opgericht om het eerste probleem 5 op te lossen. Het creëert een 6-bp "GGATCT" litteken dat Gly-Ser produceert en de fusie van meerdere eiwitten of eiwitdomeinen mogelijk maakt. IBrick is ontwikkeld om te gaan met het tweede probleem 6 . Het gebruikt homing endonucleases (HEs) die lange DNA sequenties herkennen. Aangezien de HH-herkenningssites zelden bestaan in natuurlijke DNA-sequenties, kan de iBrick-standaard gebruikt worden voor de directe constructie van iBrick-delen zonder hun DNA-sequenties te wijzigen. De iBrick-standaard laat echter een 21 bp litteken tussen de DNA-delen achter, wat de reden kan zijn voor zijn ongewildheid.
In de afgelopen jaren hebben de clusters regelmatig korte palindromische herhalingen (CRISPR) systeem is snel ontwikkeld 7 , 8 . Onder de CRISPR-geassocieerde (Cas) eiwitten wordt Cas9 endonuclease van Streptococcus pyogenes nu veel gebruikt. Het introduceert meestal dubbelstrengige DNA-pauzes (DSB's) met stompe einden 9 .
In 2015 gekenmerkt Zhang en collega's voor het eerst Cpf1 ( CRISPR van Prevotella en Francisella 1). Het behoort tot het klasse 2 type V CRISPR-Cas systeem en is een CRISRP RNA (crRNA) -geleide endonuclease 10 . In tegenstelling tot Cas9 introduceert Cpf1 een DSB met een 4 of 5 nt 5 'overhang 10 . Op basis van dit kenmerk werd Cpf1 gebruikt om een DNA-assemblage standaard, C-Brick 4 , te ontwikkelen. Op een C-Brick-standaardvector flanken vier Cpf1-doelplaatsen van voorgeprogrammeerde T1 / T2 en achtervoegsels T3 / T4 de biologische delen; Dit is vergelijkbaar met de BioBrick standaard. Als de splitsing van T2 en T3 sites pRoduces complementary sticky ends, het is mogelijk om het iteratieve assemblage van DNA-onderdelen uit te voeren, terwijl er een "GGATCC" litteken tussen de delen wordt opgewekt. Met name heeft de C-Brick-standaard twee voornaamste voordelen: herkennen van lange doelsequenties en het verlaten van korte littekens. De 6 bp "GGATCC" litteken die door C-Brick wordt gegenereerd, codeert Gly-Ser, waarmee de fusieproteïnen worden gebouwd. Bovendien is de C-Brick standaard ook gedeeltelijk compatibel met de BglBrick en BioBrick standaarden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een procedure voor de DNA-montage standaard C-Brick. De belangrijkste stap in dit protocol is de linearisering van de C-Brick standaard vector; Onvolledige splitsing van de vector kan de succesfrequentie ernstig beïnvloeden. Bovendien, hoewel Cpf1 hoofdzakelijk DNA-sequenties in het 18-23-splitsingspatroon splitst, werd onnauwkeurige splitsing nabij de twee basen ook gedetecteerd 4 , die een klein aantal mutaties kan veroorzaken na DNA-assemblage. Daarom is Sanger-sequenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken Shanghai Tolo Biotech voor hun technische bijstand tijdens de ontwikkeling van de C-Brick standaard. Dit werk werd ondersteund door subsidies uit het Strategisch Prioritaire Onderzoeksprogramma van de Chinese Academie van Wetenschappen (Grant No. XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. . Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
