सी-ईंट डीएनए मानक विधानसभा सीपीएफ 1 के लिए प्रोटोकॉल
Summary
सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन सीपीएफ 1 को एक विशेष रूप से डिजाइन किए क्रिस्प्र आरएनए (सीआरआरएनए) द्वारा निर्देशित किया जा सकता है ताकि वांछित जगहों पर डबल-फंसे डीएनए को साफ किया जा सके, चिपचिले सिरों को पैदा कर सकें। इस विशेषता के आधार पर, एक डीएनए असेंबली मानक (सी-ईंट) की स्थापना की गई थी, और इसका उपयोग करने वाले एक प्रोटोकॉल को यहाँ वर्णित किया गया है।
Abstract
सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन सीपीएफ 1 क्लिसिबल आरएनए (सीआरआरएनए) के मार्गदर्शन में डबल-फंसे डीएनए को साफ़ करता है, चिपचिले सिरों का उत्पादन करता है। इस विशेषता के कारण, सीपीएफ 1 का इस्तेमाल सी-ईंट नामक डीएनए असेंबली मानक की स्थापना के लिए किया गया है, जिसका लंबे समय से मान्यता प्राप्त साइटों और लघु निशान का लाभ है। मानक सी-ईंट वेक्टर पर, चार सीपीएफ 1 मान्यता वाली साइटें हैं – प्रीफ़िक्स (टी 1 और टी 2 साइटें) और प्रत्यय (टी 3 और टी 4 साइटें) – जैविक डीएनए भागों की चमकती हैं। टी 2 और टी 3 साइटों के क्लावेज पूरक चिपचिपा समाप्त होता है, जो टी 2 और टी 3 साइटों के साथ डीएनए भागों की विधानसभा की अनुमति देते हैं। इस बीच, एक छोटा "जीजीएटीसीसी" निशान विधानसभा के बाद भागों के बीच उत्पन्न होता है। जैसा कि नवगठित प्लाज्मिड में एक बार फिर चार सीपीएफ 1 क्लीवेज साइट्स होते हैं, इस विधि से डीएनए हिस्से के पुनरावृत्त विधानसभा की अनुमति मिलती है, जो कि जैवबरिक और बीजीएलआरिक मानकों के समान है। सी-ईंट मानक के इस्तेमाल की रूपरेखा डीएनए भागों को इकट्ठा करने के लिए एक प्रक्रियायहाँ वर्णित है सी-ईंट मानक वैज्ञानिक, स्नातक और स्नातक छात्रों द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है, और यहां तक कि शौकीनों भी।
Introduction
सिंथेटिक जीव विज्ञान 1 के विकास के लिए डीएनए जैविक भागों का मानकीकरण महत्वपूर्ण है एक डीएनए विधानसभा प्रक्रिया का विकास तदर्थ प्रायोगिक डिजाइनों को बदल सकता है और बड़े प्रणालियों में आनुवंशिक घटकों की विधानसभा के दौरान उत्पन्न कई अप्रत्याशित परिणामों को निकाल सकता है। बायोबरिक मानक (बीबीएफ आरएफसी 10) सबसे पहले प्रस्तावित डीएनए विधानसभा मानकों में से एक था। यह उपसर्ग अनुक्रम (इकोआरआई और एक्सबाआई काटिंग साइट्स) और प्रत्यय अनुक्रम (स्पीआई और पीएसटी काटने वाली साइट्स वाले) 2 , 3 का उपयोग करता है । चूंकि एक्सबाआई और स्पीआई में पूरक एकत्रीय छोर हैं, क्योंकि एक्सबाआई और स्पीआई से कटौती की जाने वाली जैवबरिक डीएनए हिस्से को एक साथ जोड़ लिया जा सकता है, और आगे चलने वाले विधानसभा के लिए एक नया जैवबरिक पैदा कर सकता है।
BioBrick मानक 4 के उपयोग के साथ कुछ दोषों को पहचान लिया गया है। उदाहरण के लिए, यह एक 8-बीपी निशान पैदा करता हैडीएनए भागों के बीच, जो संलयन प्रोटीन के निर्माण की अनुमति नहीं देता है इसके अलावा, चार उपर्युक्त प्रकार के 6-बीपी प्रतिबंध साइटों को डीएनए भागों से हटा दिया जाना चाहिए, जो बहुत असुविधाजनक है। पहली समस्या को सुलझाने के लिए BglBrick मानक स्थापित किया गया था 5 । यह एक 6-बीपी "जीजीएटीसीटी" निशान बनाता है, जिससे Gly-Ser का उत्पादन होता है और कई प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन के संलयन के लिए अनुमति देता है। द्वितीय समस्या से निपटने के लिए iBrick विकसित किया गया था 6 यह होमिंग एंडोनक्लाक्लेज़ (हेई) का इस्तेमाल करता है जो लंबे डीएनए दृश्यों को पहचानते हैं। चूंकि आईआईआर मान्यता वाले साइटें शायद ही कभी प्राकृतिक डीएनए दृश्यों में मौजूद होती हैं, आईबीआईआर मानक उनके डीएनए दृश्यों को संशोधित किए बिना iBrick भागों के प्रत्यक्ष निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, iBrick मानक डीएनए भागों के बीच एक 21 बीपी निशान छोड़ देता है, जो इसकी अलोकप्रियता का कारण हो सकता है।
हाल के वर्षों में, संकुल नियमित रूप से छोटे पतली पुनरावृत्ति (सीआरआईएसपीआर) प्रणाली तेजी से 7 , 8 विकसित की है। सीआरआईएसपीआर-जुड़े (कैस) प्रोटीन के बीच, स्ट्रैपटोकोकस पायोजनेस से कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ अब व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। यह अधिकतर दोहरे फंसे हुए डीएनए ब्रेक (डीएसबी) को शुरू करता है, जो कुंद के साथ 9 होता है।
2015 में, झांग और सहकर्मियों ने पहली बार सीपीएफ 1 ( प्रीवोटेला और फ्रांसिसेला 1 से सीआरआईएसपीआर ) का वर्णन किया । यह क्लास 2 प्रकार वी क्र्रिस्प-कैस सिस्टम से संबंधित है और यह एक सीआरआईएसआरपी आरएनए (सीआरआरएनए) है – एंटीऑन्यूच्यूड 10 द्वारा उठाया गया है । कैस 9 के विपरीत, सीपीएफ 1 ने एक डीएसबी को 4 या 5 एनटी 5 '10 ओवरहेंग लगाया है इस विशेषता के आधार पर, सीपीएफ 1 का उपयोग डीएनए असेंबली मानक, सी-ईंट 4 को विकसित करने के लिए किया गया था। एक सी-ईंट मानक वेक्टर पर, प्रीफ़िक्स्ड टी 1 / टी 2 के चार सीपीएफ 1 लक्ष्य साइट और टी 3 / टी 4 युक्त जैविक हिस्से की परतें; यह BioBrick मानक के समान है टी 2 और टी 3 साइटों की दरार के रूप मेंपूरक चिपचिपा समाप्त होता है, भागों के बीच एक "जीजीएटीसीसी" निशान पैदा करते हुए डीएनए भागों की पुनरावृत्ति विधानसभा प्रदर्शन करना संभव है। विशेष रूप से, सी-ईंट मानक के दो मुख्य लाभ हैं: लंबे लक्ष्य अनुक्रम को पहचानना और लघु निशान छोड़ना। सी-ईंट द्वारा उत्पन्न 6 बीपी "जीजीएटीसीसी" निशान, ग्लासी-सर्कोड करता है, जो संलयन प्रोटीन के निर्माण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, सी-ईंट मानक भी आंशिक रूप से BglBrick और BioBrick मानकों के साथ संगत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल डीएनए विधानसभा मानक सी-ईंट के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम सी-ईंट मानक वेक्टर के रैखरीकरण है; सदिश का अधूरा तराजू सफलता की दर को गंभीरता से प्रभा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सी-ईंट मानक के विकास के दौरान हम अपनी तकनीकी सहायता के लिए शंघाई टैलो बायोटेक का धन्यवाद करते हैं। यह काम चीनी अकेडमी ऑफ साइंसेज (ग्रांट नं। XDB19040200) के सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित था।
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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