Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry
Summary
Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.
Abstract
Talrijke studies hebben de rol van immuuncellen, in het bijzonder macrofagen, in pathologieën van het centrale zenuwstelsel (CNS) aangetoond. Er zijn twee belangrijke macrofage populaties in het CNS: (i) de microglia, die de inwendige macrofagen van het CNS zijn en afgeleid zijn van de bloedsomlooppromotoren tijdens embryogenese, en (ii) de monocyt-afgeleide macrofagen (MDM), die kunnen infiltreren Het CNS tijdens de ziekte en zijn afgeleid van beenmerg progenitors. De rollen van elke macrofage subpopulatie verschillen afhankelijk van de pathologie die wordt bestudeerd. Verder is er geen consensus over de histologische markers of de onderscheidende criteria die voor deze macrofage subpopulaties worden gebruikt. De analyse van de expressieprofielen van de CD11b- en CD45-markers door middel van flowcytometrie laat ons echter toe om de microglia (CD11b + CD45 med ) van de MDM (CD11b + CD45 high ) te onderscheiden. In dit protocol laten we zien dat de dichtheidsgradiëntcentrifugatieEn de flow cytometry analyse kan worden gebruikt om deze CNS macrofage subpopulaties te karakteriseren, en te onderzoeken verschillende markers van interesse uitgedrukt door deze cellen zoals we onlangs gepubliceerd. Zo kan deze techniek ons begrip van de rol van macrofagen in muismodellen van neurologische aandoeningen verlenen en kunnen ook gebruikt worden om medicijn effecten op deze cellen te evalueren.
Introduction
De microglia zijn de parenchymale weefsel-ingezeten macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen twee belangrijke functionele rollen: immuniteitsverdediging en onderhoud van de CNS homeostase. In tegenstelling tot de MDM, die voortdurend worden vernieuwd van de hematopoietische stamcellen in het beenmerg, onderscheiden de microglcellen zich van primitieve hematopoietische stamcellen die afkomstig zijn uit de dooierzak (YS) die de hersenen coloniseerde tijdens de embryonale ontwikkeling 1 , 2 , 3 . Bij knaagdieren speelt de transcriptiefactor Myb een cruciale rol in de ontwikkeling van alle botmengsel afgeleide monocyten en macrofagen, maar voor YS-afgeleide microglia is deze factor onafwendbaar en differentiatie blijft afhankelijk van de transcriptiefactor PU.14.
In het gezonde CNS zijn microglia dynamische cellen die hun omgeving constant sconenNning en opmeting voor invallende pathogenen of weefselschade 5 . De detectie van dergelijke signalen initieert een weg om het letsel op te lossen. De microglia verandert snel van een geamplificeerde morfologie naar een amoeboid, die gevolgd wordt door fagocytose en vrijlating van verschillende mediators, zoals pro- of anti-inflammatoire cytokinen. Zo kan, afhankelijk van hun microomgeving, geactiveerde microglia een spectrum van verschillende primingstaten 6 verwerven.
De microglia beïnvloedt de ontwikkeling en de voortgang van veel neurologische aandoeningen. In de knaagdiermodellen van de ziekte van Alzheimer (AD) 7 , Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) 8 , Multiple Sclerose (MS) 9 of Parkinsonziekte (PD) 10 , blijkt de microglia een dubbele rol te spelen, hetzij veroorzaken van nadelige neurotoxiciteit of het optreden van Op een neuroprotectieve manier, die afhankelijk is van oN de specifieke ziekte, het ziekte stadium en of de ziekte werd beïnvloed door het systemische immuuncompartiment 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De meeste van de CNS-letsels waargenomen in de bovengenoemde ziekten bevatten een heterogene populatie van myeloïde cellen, waaronder niet alleen parenchymale microglia, maar ook perivasculaire en meningale macrofagen, evenals CNS-infiltrerende MDM. Deze celtypen kunnen differentieel bijdragen aan de pathofysiologische mechanismen die verband houden met verwonding en reparatie 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . De huidige uitdaging voor onderzoekers die deze ziektemodellen bestuderen, is om vast te stellen of de perifere monocyten en macrofagen het CNS infiltreren en zoDe inwoner microglia van deze cellen. Inderdaad, de microglialcellen zijn zeer plastic; Wanneer ze geactiveerd worden, herhalen de microglia markers die gewoonlijk worden uitgedrukt door perifere monocyten en macrofagen. Het probleem is derhalve gebaseerd op het identificeren van markers die de residente microglia kunnen onderscheiden van de infiltrerende monocyten en macrofagen.
De discriminatie van deze populaties op hersenplakken door immunohistologische toepassingen is beperkt door het gebrek aan specifieke antilichamen. Flowcytometrie-analyse is echter een efficiënte techniek om de expressie van verschillende markers te beoordelen en celpopulaties te onderscheiden (bijvoorbeeld lymfocyten, macrofagen / MDM CD11b + CD45 high en microglia CD11b + CD45 med ), evenals subpopulaties 16 van de cel , 17 , 18 . Dit protocol beschrijft de procedures voor het isoleren van deMononucleaire cellen uit het CNS van de muis in neurologische ziekte modellen door gebruik te maken van een geoptimaliseerde, enzymatische weefdissociatie en een dichtheidsgradiëntcentrifugatie; Evenals een methode voor het differentiëren van de microglia- en MDM-populaties in het CNS door gebruik te maken van flowcytometrie.
Een andere benadering is om de myelin te elimineren en de cellen te zuiveren door gebruik te maken van magnetische kralen geconjugeerd aan specifieke antilichamen 19 , 20 , 21 . Het verwijderen van myelin met behulp van anti-myelin magnetische kralen is duurder en beïnvloedt de levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde cellen 22 . Deze stap en de volgende immunomagnetische scheiding van de microglia beperken verdere studies van specifieke immuuncellenpopulaties 21 , 22 .
Deze procedures bieden een makkelijke manier om de macrofage subpopulaties bij ziekteontwikkeling te bestuderen, enHet bepalen van de geneesmiddeleffecten of genmodificaties op macrofagenfenotypen en activeringsstaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is aangetoond dat de microglia en MDM verschillende functies en fenotypen in het CNS hebben en daarom zijn de identificatie en analyse van deze macrofage subpopulaties essentieel om de neurologische ziekten 9 , 18 , 25 beter te begrijpen. Flowcytometrie analyse met behulp van twee markers (CD11b en CD45) maakt het onderscheid mogelijk tussen elke subpopulatie ( Figuur 3C ). Deze strategie werd …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer en Bpifrance. Ons laboratorium wordt ook ondersteund door Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie en het programma "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Wij danken de hulp van de CELIS celcultuur kern faciliteit.
Materials
| 5-month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1,5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?. Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson’s disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer’s disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
