Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo
Summary
Immunolabeling methoden voor het analyseren van verschillende populaties van microtubuli in de ontwikkelende hersenen van de zebravis zijn hier beschreven, die over het algemeen van toepassing zijn op andere weefsels. Het eerste protocol schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling stabiele en dynamische microtubuli. Het tweede protocol biedt een methode om beeld en kwantificeren van ontluikende microtubuli specifiek.
Abstract
Microtubuli (MTs) zijn dynamisch en broos structuren die uitdagend om te afbeelding in vivo, met name in gewervelde embryo’s zijn. Immunolabeling methoden worden hier beschreven om te analyseren verschillende populaties van MTs in de ontwikkelingslanden neurale buis van de zebravis embryo. Terwijl de nadruk op zenuwweefsel ligt, geldt deze methode in grote lijnen voor andere weefsels. De procedures zijn geoptimaliseerd voor vroeg tot midden-somitogenesis-fase embryo’s (1 Somiet tot 12 somieten), maar ze aangepast aan een scala aan andere etappes met relatief kleine aanpassingen worden kunnen. Het eerste protocol biedt een methode voor het beoordelen van de ruimtelijke spreiding van stabiele en dynamische MTs en een kwantitatieve analyse van deze populaties met beeld-verwerkende software uit te voeren. Deze aanpak vormt een aanvulling op bestaande hulpprogramma’s voor afbeelding microtubulus dynamiek en distributie in real-time, met behulp van transgene lijnen of voorbijgaande uitdrukking van tagged constructies. Inderdaad, dergelijke hulpmiddelen zijn zeer nuttig, maar ze maken geen gemakkelijk onderscheid tussen dynamische en stabiele MTs. De mogelijkheid om beeld en analyseren van de populaties van deze verschillende microtubulus heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van mechanismen ten grondslag liggen aan de cel polarisatie en voedselproductie. Het tweede protocol schetst een techniek voor het analyseren van ontluikende MTs specifiek. Dit wordt bereikt door het vastleggen van de DOVO groei eigenschappen van MTs na verloop van tijd na microtubulus depolymerization met de nocodazole van de drug en een herstelperiode na drug wassen. Deze techniek heeft nog niet vereffend op de studie van MTs in zebrafish embryo’s, maar is een waardevolle assay voor het onderzoeken van de functie in vivo van eiwitten die betrokken zijn bij de vergadering van de microtubuli.
Introduction
Microtubuli (MTs) zijn polymeren van α – en β-tubuline dat tot lineaire protofilaments samenvoegen, waarvan er verscheidene combineren om te vormen van een holle buis1,2. MTs zijn gepolariseerde structuren, met snelgroeiende plus uiteinden en langzaam groeiende minus uiteinden die zijn verankerd in de centrosoom of andere microtubulus-organiseren center (MTOC)3. DOVO MT vorming wordt geïnitieerd door nucleatie op de complexe γ-tubuline-ring (γ-TURC), waarmee een sjabloon voor MT vergadering4. In een bepaalde cel kunnen twee populaties van MTs worden onderscheiden die draaien tegen verschillende tarieven. Dynamische MTs verkennen hun cellulaire omgeving door te schakelen tussen de fasen van groei en krimp in een proces dat bekend staat als dynamische instabiliteit5. In tegenstelling tot dynamische MTs, stabiele MTs zijn niet-groeiende en hebben een langere halfwaardetijd dan dynamische MTs6.
Decennia van onderzoek in de celbiologie heeft geboden een verfijnde allerlei tools om te studeren MT structuur en functie en resulteerde in een grote hoeveelheid kennis over deze cytoskeletal elementen. Bijvoorbeeld, MTs spelen een centrale rol bij de totstandbrenging en het onderhoud van de polariteit van de cel, die toe te schrijven niet alleen aan hun intrinsieke polariteit, maar ook voor de differentiële subcellular verdeling van stabiel versus dynamische MTs7, is 8. daarentegen veel minder is begrepen over MT architectuur en functie in meer complexe driedimensionale (3-D) omgevingen, zoals het gewervelde embryo, gedeeltelijk als gevolg van de uitdaging van het cytoskelet van de MT op hoge resolutie beeldvormende. Niettegenstaande deze beperking, de recente generatie GFP-uiting te geven aan transgene lijnen dat label MTs of voorbijgaande expressie van fluorescently-tagged MT markers toegenomen ons begrip van de dynamische veranderingen die MTs ondergaan en hun cellulaire en Developmental rol in de zebravis embryo. Het hele MT-netwerk kan worden beeld in transgene lijnen in welke tubuline is ofwel rechtstreeks gelabelde9 of tubuline polymeren niet indirect worden aangeduid met behulp van MT-geassocieerde eiwitten Doublecortin-like-kinase (Dclk) of Ensconsin (EMTB)10, 11. Andere lijnen (en constructies) zijn gegenereerd die beoordeling van MT intrinsieke polariteit inschakelen door specifiek labeling MT plus eindigt of centrosoom-verankerd minus uiteinden11,12,13, 14. de kracht van deze tools ligt in de mogelijkheid te bestuderen van MT dynamiek in leven, ontwikkeling van organismen. Dergelijke studies is gebleken dat, bijvoorbeeld, de ruimtelijke en dynamische verdeling van MTs in specifieke cel populaties, de oriëntatie van de mitotische spindles in weefsels morfogenese (een indicator van het vliegtuig van celdeling), ondergaan de polariteit van het MT-polymeer met betrekking tot processen zoals cel rek en migratie, en MT groeitempo op jaarbasis bepaald door komeet snelheid9,13,15. De beperking van deze tools is dat ze niet gemakkelijk tussen stabiele en dynamische MT populaties discrimineren.
Tekening uit de rijke cel biologie literatuur, worden immunolabeling methoden om het imago van stabiele en dynamische MTs in de zebravis embryo hier beschreven, die zijn een aanvulling op het gebruik van transgene lijnen. Het wijdverbreide gebruik van dergelijke methodes van de immunolabeling in de zebravis enigszins belemmerd door de moeilijkheid in het MT integriteit behouden tijdens de procedure fixatie. Protocol 1 schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling totaal, dynamische, en stabiele MTs in grensoverschrijdende secties van de ontwikkelingslanden zebrafish hindbrain. Bovendien, een eenvoudige methode met behulp van commercieel beschikbare software wordt beschreven om het kwantificeren van de populaties van deze MT. Stabiele MTs onderscheiden zich van dynamische MTs gebaseerd op verschillende posttranslationele modificaties van α-tubuline, zoals acetylation en detyrosination, die op stabiele MTs in de tijd16,17 accumuleren. In het embryo van de zebravis, vindt acetylation plaats op Ciliaire en axonale MTs maar niet op stabiele interfase MTs18, beperking van het nut van deze markering tot een subset van gestabiliseerde MTs. Daarentegen lijkt detyrosination optreden op alle stabiele MTs in de zebravis embryo18. Deze posttranslationele wijziging blootstelt de glutaminezuur carboxy-terminal van α-tubuline (detyrosinated tubuline)18 en kan worden opgespoord met behulp van anti-Glu-tubuline19. Hoewel detyrosination bij voorkeur op stabiele MTs plaatsvindt, experimenteel bewijs geeft aan dat deze posttranslationele wijziging een gevolg van, in plaats van een doodsoorzaak, MT stabiliteit16. De wederzijdse MT bevolking, samengesteld uit dynamische MTs, onderscheidt zich met behulp van een antilichaam, anti-Tyr-tubuline, die specifiek de tyrosinated vorm van α-tubuline19herkent. Na immunolabeling met deze markeringen en confocal beeldvorming, de kwantitatieve analyse van MTs (lengte, aantal en relatieve overvloed) kan worden uitgevoerd in bepaalde regio’s van de ontwikkeling van de neurale buis. Een gestroomlijnde methode is hier geboden voor het uitvoeren van deze analyse met behulp van 3D-beeldverwerking software. Deze methode kan worden toegepast om vragen te stellen met betrekking tot voedselproductie en de inrichting of de rijping van cel polariteit20. Inderdaad, de uitwerking van gepolariseerde arrays van stabiele MTs begeleidt veel developmental evenementen, waaronder fotoreceptor morfogenese21, epithelialization van cellen in de ontwikkelingslanden neurale buis18 en axon vorming8.
Protocol 2 beschrijft een in vivo -bewerking van een cel biologie assay voor het analyseren van MTs tijdens hun vergadering fase (nucleatie/anchorage en groei)22,23. Ontluikende MTs zijn nucleated op de centrosoom en vervolgens verankerd aan de subdistal aanhangsels van de moeder centriool23. Een methode voor het analyseren van de ontluikende MT hergroei na depolymerization wordt beschreven. Dit protocol bevat details over de behandeling van de nocodazole aan de depolymerize van MTs, de drug washout-procedure en de herstelperiode na de behandeling. MT uitgroei is gecontroleerd op regelmatige intervals post wassen door immunolabeling met markeringen voor totale MTs (anti β-tubuline) naast markers voor het centrosoom (anti γ-tubuline) en kern (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), volgens de algemene procedures beschreven in Protocol 1. De MT depolymerization stap van dit protocol is essentieel omdat hierdoor beoordeling van DOVO MT groei en uitbreiding van bestaande MTs niet. Deze techniek verschilt dus van andere gepubliceerde procedures voor het meten van MT groeicijfers (in afwezigheid van depolymerization) met behulp van een plus tip marker zoals einde bindende eiwit 3 gesmolten tot groen fluorescent proteïne (EB3-GFP), zoals in Tran et al., 201211. Bovendien, deze bepaling is met name handig voor het analyseren van de embryo’s met gebreken in DOVO MT vergadering, zoals de eerder gemelde NEDD1 mutanten waarin rekrutering van γ-tubuline tot de centrosoom bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat resulteert in onvolledige de formatie van de neurale buis en neuronale gebreken24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn momenteel vele methoden voor imaging-MT dynamiek in de vroege ontwikkeling van de zebravis, variërend van levende beeldvorming van tagged moleculen tot immunolabeling van vaste weefsel11,12,13,14. Hoewel MTs in één cel kunnen bestaan in dynamische of stabiele staten, is epithelialization een proces waarin de MTs is geleidelijk gestabiliseerd na verloop van tijd. Met behulp van merker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De confocal microscoop werd gekocht met geld van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF), subsidie #DBI-0722569. Het onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse nationale instituten van gezondheid/nationale Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) subsidie #GM085290 en Amerikaanse departement van defensie (DOD) subsidie #W81XWH-16-1-0466 toegekend aan R.M. Brewster. E. Vital werd gesteund door een subsidie naar UMBC van het Howard Hughes Medical Institute via de pre college en Undergraduate Science Education Program, verlenen van #52008090. S.P. Brown werd ondersteund door een Amerikaanse departement van onderwijs GAANN Fellowship, een Meyerhoff Graduate Fellowship gefinancierd door subsidie van het NIH/NIGMS, #GM055036, en een onderzoek assistentschap gefinancierd door de V.S. DOD subsidie #W81XWH-16-1-0466.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
