نقص الأكسجين المسبق للخلية السلف المستمدة من نخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة
Summary
خلايا انسجة النخاع (مسس) مع وجود إمكانات عصبية داخل نخاع العظم. بروتوكول لدينا يثري هذه المجموعة من الخلايا عن طريق مسبق نقص الأكسجين، وبعد ذلك يوجه لهم لتصبح خلايا شوان ناضجة.
Abstract
تصف هذه المخطوطة وسيلة لإثراء الأسلاف العصبية من الخلايا اللحمية نخاعي (مسك) السكان وبعد ذلك لتوجيهها إلى مصير شوان الخلية ناضجة. لقد أخضعنا مسس الفئران والانسان لظروف نقص الأكسجين العابرة (1٪ من الأكسجين لمدة 16 ساعة)، يليه التوسع كالعصب العصبية على الطبقة المنخفضة المرفق مع عامل نمو البشرة (إغف) / عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (بفغف). تم تربيط الأعصاب على البلاستيك زراعة الأنسجة بولي-D- يسين / لامينين المغلفة والمثقفة في كوكتيل غليوجين يحتوي على β- هيريغولين، بفغف، وعامل النمو المشتقة من الصفيحات (بدغف) لتوليد شوان خلايا تشبه الخلايا (سكلس). تم توجيه سكلس إلى مصير الالتزام عبر كوكولتشر لمدة 2 أسابيع مع العصبية الجذر الظهرية المنقى (درغ) الخلايا العصبية الحصول عليها من E14-15 الحوامل سبراغ داولي الفئران. الخلايا الناضجة شوان تثبت استمرار في التعبير S100β / p75 ويمكن أن تشكل قطاعات المايلين. الخلايا التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة لها إمكانات أببلتيونس في زرع الخلايا الذاتية بعد إصابة الحبل الشوكي، وكذلك في النمذجة المرض.
Introduction
زرع الأسلاف العصبية ومشتقاتها يدل على الوعد كاستراتيجية علاج التالية إصابة العصب الصدمة 1 ، 2 والتنكس العصبي 3 ، 4 . قبل التطبيق السريري، فمن الضروري ضمان: ط) وسيلة للوصول والتوسع على مصدر ذاتي من الخلايا الجذعية / السلف و 2) وسيلة لتوجيهها إلى ذات الصلة، وأنواع الخلايا الناضجة 3 . اهتمامنا في العلاج بالخلايا لإصابة الحبل الشوكي أدى بنا إلى السعي قوية، مصدر خلية ذاتي من الأسلاف العصبية من أنسجة الكبار.
وهناك مجموعة فرعية من اللجان الدائمة تنشأ من قمة العصبية ويمكن الوصول إليها بسهولة من تجويف نخاع. هذه الخلايا هي الأسلاف العصبية التي يمكن أن تولد الخلايا العصبية والدبقية 5 . نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية تثبت أن نقص الأكسجين يعزز برول إفيراتيون و مولتيبوتنسي من الأسلاف العصبية داخل الدماغ 6 . وكان هذا هو الأساس لاستخدام شرط مسبق الأكسجين كوسيلة للتوسع على الأسلاف العصبية المستمدة من نخاع.
زرع خلايا شوان في الحبل الشوكي المصاب يعزز التجديد 2 . يمكن إنشاء سكلس من اللجان الدائمة عن طريق المكملات مع العوامل الهليوجين ( أي، هيريغولين،، بفغف، و بدغف-آ) ولكنها تظهر عدم الاستقرار الظاهري. على سحب عوامل النمو، فإنها تعود إلى النمط الظاهري مثل الليفية 7 . عدم الاستقرار المظهري غير مرغوب فيه في زرع الخلايا بسبب خطر التمايز الشاذة والسرطنة. كما ترتبط السلائف الخلية شوان مع حزم محور عصبي داخل العصب الطرفية الجنينية 8 ، كنا قاد إلى سكلكتور كوكولتشر مع الخلايا العصبية درغ الجنينية المنقى 7 ،أس = "كريف"> 9. الناتجة ناضجة خلايا شوان هي مصير ملتزمة وتظهر وظيفة في المختبر 7 ، 9 وفي الجسم الحي 10 .
بروتوكول لدينا لتخصيب الأسلاف العصبية من اللجان الدائمة هو بسيط وفعال ويؤدي إلى زيادة في عدد الخلايا لفحوصات لاحقة. اشتقاق الخلايا شوان الملتزمة مصير عبر منصة كوكولتشر يسمح لدراسة التمايز الدبقية ولتوليد خلايا شوان مستقرة وظيفية للتطبيق السريري المحتمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
فمن الضروري للحفاظ على "الجذعية" من اللجان الدائمة قبل إثراء الأسلاف العصبية عن طريق مسبق الأكسجين الثقافة و نيوروسفهير. من تجربتنا، مسس مولتيبوتنت يمكن تحديدها بشكل موثوق بها من قبل ممدود تشبه الخلايا الليفية مورفولوجيا. في المقابل، مسس التي اعتمدت مورفولوجي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور ناي – سوم وونغ لتوفير جهاز غرفة نقص الأكسجين والسيدة أليس لوي للدعم التقني.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
