우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상적인 유선 분비는 환경 독성 물질 및 의약품에 노출되거나 호르몬에 과도하게 노출되거나 유전 적 변형이 일어날 수 있습니다. 유선 전체 마운트는 노출 후에 발생할 수있는 형태 학적 변화의 진행을 포착하기위한 저렴한 방법입니다. 그러나 비정상 성이 더 많이 발생하기 시작하는 나중의 삶에서,이 한 가지 방법에 대한 단독 신뢰가 항상 이상의 적절한 진단을 내리기에 충분한 정보를 제공하지 못할 수도 있습니다. 역사적으로, 화학 테스트 가이드 라인 연구에서 단일 유선이 부검시 제거되고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 된 섹션으로 준비됩니다. 반대쪽 유방 전체 수집 및 분석의 통합은 위음성 평가의 가능성을 줄입니다. 전체 마운트의 평가는 슬라이드에 하나 또는 두 개의 전체 유선이 존재하는 경우에 제한적이며 경우에 따라 전체 마운트에서 관찰 된 이상은 없습니다.t는 H & E 섹션에서 균일하게 표현됩니다. 이 연구의 목표는 달리 덮어 버렸거나 진단하기 어려운 병변을 식별 할 수 있도록 coverslpped mammary 전체 마운트를 H & E로 염색 된 절편으로 변환하기위한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 여기서는 처음에 전체 마운트로 준비된 유선으로부터 고품질의 파라핀이 포함 된 H & E 섹션을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. H & E 절단을 위해 의도적으로 준비된 조직과 비교하여, 전체 마운트는 조직 제거 및 처리를위한 추가 준비를 필요로합니다. 그러나이 방법은 일반적인 실험용 시약과 약간의 추가 시간이 필요하기 때문에 값이 싸다. 결과적으로,이 방법은 화학적 및 환경 적 노출로 인해 정상적인 유방 발달을 어떻게 변화시키고 유전 적 변형으로 인해 발생하는 변화를 디스플레이하는지에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.
서론
mammary whole mountis는 정상적이고 화학적으로 유도 된 비정상적인 발달을 이해하기 위해 많은 쥐와 마우스 연구에서 구현 된 유용하고 저렴한 방법입니다. 일반적으로 설치류 개발 단계 ( 예 : 사춘기, 사춘기, 중기 - 후기 및 출생기)에 여러 단계로 수집 된 유선은 우상, 내분비 및자가 분비 인자에 의해 영향을받는 조직 및 세포 구조의 형태 학적 변화를 보여줍니다 1 . 노화 된 쥐에서, 선의 상피 및 간질 부분이 점차적으로 밀도가 높아져서 전체적인 형태로 형태 학적 매개 변수를 측정하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 미시적 수준의 변화를 확인하기 위해 조직 학적 평가를 위해 림프를 수집하는 것이 일반적입니다. 두 공정 모두 화학적 노출 ( 즉, 환경 적 또는 약학 적)과 관련된 연구 또는 유전 적 변화에 따른 형태 학적 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다ations.
위험 평가에서 유선을 사용하기위한 기술과 기능은 계속 진화하고 있습니다. 전체 장착 준비가 일상적이고 표준화되어있는 반면, 절편 수정은 2 , 3 단계로 이어 집니다. 일부 실험실....
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프로토콜
이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물
보살핌 및 사용위원회와 협회의 평가 및 인정 협회에서
실험 동물 관리 인증 시설.
1. 유방 전체 마운트 준비 2 , 3 , 6 , 7
- 참조 3에 설명 된대로 임신하지 않은 CD - 1 암컷 마우스의 한쪽에서 사타구니의 유선을 제거하고 정전기가있는 슬라이드에 올려 놓습니다.
- 글 랜드를 붙지 않는 종이 또는 필름으로 덮고 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 글 랜드가 슬라이드에 고정되어 고정되도록 글 랜드를 평평하게 펼치기 위해 슬라이드에 압력 ( 예 : 물 무게)을가하십시오.
- 슬라이드를 고정액 ( 예 : 100 % 에탄올, 클로로포름, 빙초산 6 : 3 : 1 비율)에 담근다.실온에서 하룻밤.
- 정착액에서 땀샘을 제거하고 에탄올에서 15-30 분 동안 씻으십시오. 30 분 세척 후에 에탄올 1/3을 붓고 물을 가하여....
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결과
이 방법은 유방 패드의 원래 대 측성 H & E 섹션에 조직 학적 변화가 나타나지 않으면 놓치기 쉬운 진단을 돕는 데 효과적입니다. 그러나 결과는 조직 학적 평가를위한 조직 준비 과정뿐만 아니라 초기 전체 마운트 준비 과정에서주의를 기울이는 경우에만 유용합니다. 파라핀 삽입은 보호를 제공하고 장래의 절개를 위해 조직을 보존하는 데 도움이됩니다.
유방 조직의 이상적인 두께를 결정하기 위해 4 μm 및 6 μm 단면을 준비했습니다. 우리는 마이크로톰에서 ± 1μm의 오차 범위보다 큰 깊이를 시험했다. 6 μm 두께의 섹션 ( 그림 1A )은 컴팩트 한 셀로 매우 밀집되어있었습니다. 전반적으로, 슬라이드에는 적절한 식별 정보를 작성하는 데 필요한 개별적인 세포 세부 정보가 부족했습니다.ication. 최적의 두께는 4 μm ( .......
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토론
유선의 전체 마운트는 내분비 교란 물질을 포함한 화학 물질에 노출 된 후에도 발생할 수있는 정상적인 유방 발달 및 형태 학적 변화를 설명하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 동일한 동물의 전체 산과 H & E 섹션을 함께 평가하면 조기 변경에 대한 정확한 시각적 스냅 샷을 제공 할 수 있으며, 이는 더 병이있는 상태로 진행될 수 있습니다.
이 유용한 정보를 얻을 수있는 능력은 조직을 제거 할 때 선 형태를 보존하고 손상시키지 않도록주의를 기울이는 데 있습니다. 설치류가 등쪽 벽을 따라 양측에 위치하는 여러 유선 위치를 가지고 있지만 근육 조직 회복을 최소화하기 위해 4 th 및 5 th 땀샘을 수집하는 것이 좋습니다. 젖꼭지 부착 영역과 림프절도 유용한 형태 학적 지표로 사용되어야합니다. 글 랜드도 펼쳐져 있고 스트레칭되어야합니다.평평한 표면 ( 예 : 유리 슬라이드, 카드지 또는 천)을 가로 질러 붙어서 조.......
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공개 사항
저자는이 기사의 연구, 저자 및 / 또는 출판과 관련하여 선언 할 수있는 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
저자는이 프로젝트에 대한 기술적 전문성과 지원으로 Pam Ovwigho, Tenette Jones 및 NIEHS의 Natasha Clayton을 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | 마운팅 미디어는 전체 마운트 및 H&를 커버슬립합니다. E 섹션 |
| Leica 자동화 프로세서 | Leica Biosystems | 모델 # ST5020 | |
| HM 355S 자동 마이크로톰 | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| 파라핀 | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 정전기 충전 |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | 커버슬립 |
| Varistain Gemini ES 자동 슬라이드 염색기 | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | 액체 접착제; 수조에서 사용됨 |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific의 일부) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| 리튬 카보네이트 | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| 빙하 아세트산 | 열 Fisher Scientific | A38-500 | Carnoy의 고정액 |
| 클로로포름 | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | 필요함 Carnoy의 고정액 |
| 100% 에탄올 | Warner Graham Company | 6505001050000 | Carnoy의 고정액 및 세척 슬라이드에 필요 |
| 95% 에탄올 | Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| 알루미늄 황산칼륨 수화물, 시그마 울트라 | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| 자동화 세척 버퍼, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
참고문헌
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M.
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재인쇄 및 허가
