Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Summary

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca^{2 +} reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Abstract

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca^{2 +} para a contração, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante o relaxamento. A SR Ca^{2 +} reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca^{2 +} é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca^{2 +} loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa^{2 +} reserva e diastólica Ca^{2 +} remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca^{2 +} fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca^{2 +} lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) e at⁺-Ca^{2 +} trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.

Introduction

Cálcio intracelular ([Ca^{2 +}]_eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes¹. Como sabemos, induzida por cálcio Ca^{2 +} versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca^{2 +} canais, que induzem Ca^{2 +} lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca^{2 +} inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca^{2 +} é reuptaken para o SR mediante o SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos através^{do nd+-Ca 2 +} trocador (NCX)². Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.

O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca^{2 +} para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca^{2 +} durante o relaxamento. A SR Ca^{2 +} reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca^{2 +} é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca^{2 +} desembaraço e deprimido SR Ca^{2 +} pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca^{2,3 ,4}.

Para medir o SR Ca^{2 +} liberação e diastólica Ca^{2 +} remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira^5,6e o Ca induzida por cafeína ^{2 +} pulso baseado no Ca^{2 +} fluorescência de imagem^7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca^{2 +} libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca^{2 +} reserva e Ca^{2 +} remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca^{2 +} pulso com base em um Ca^{2 +} fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca^{2 +} fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca^{2 +} lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca^{2 +} diastólica em conformidade.

Protocol

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal. 1. preparação da solução preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1. 2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes Nota:…

Representative Results

Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) – induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague – Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia > 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolado…

Discussion

Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca^{2 +} para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca^{2 +} conteúdo e o fracionário Ca^{2 +} libertado o SR refletir SR Ca^{2 +} reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca^{2 +} reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca^{2 +} , Ca^{2 +} vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole^12,…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436