Sarcoplasmic जालिका कैल्शियम रिजर्व और Intracellular डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने में अलग वेंट्रिकुलर Cardiomyocytes का आकलन
Summary
Intracellular कैल्शियम रीसाइक्लिंग cardiomyocytes में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहाँ, हम एक कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली द्वारा cardiomyocytes में sarcoplasmic जालिका Ca2 + रिजर्व और डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
Intracellular कैल्शियम रीसाइक्लिंग cardiomyocytes में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कार्डियक sarcoplasmic जालिका (SR) संकुचन के लिए एक सीए2 + जलाशय के रूप में कार्य करता है, जो छूट के दौरान intracellular ca2 + reuptakes । SR ca2 + धड़कता के लिए उपलब्ध आरक्षित कार्डियक contractibility के लिए समाप्त है, और intracellular Ca के हटाने2 + कार्डियक डायस्टोलिक समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । कुछ pathophysiological शर्तों के तहत, जैसे मधुमेह और दिल की विफलता, बिगड़ा कैल्शियम क्लीयरेंस और एसआर सीए2 + स्टोर cardiomyocytes में हृदय रोग की प्रगति में शामिल हो सकता है । यहां, हम SRCa2 + आरक्षित और डायस्टोलिक Ca2 + हटाने का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । संक्षेप में, एक एकल cardiomyocyte enzymatically पृथक किया गया था, और intracellular Ca2 + प्रतिदीप्ति द्वारा इंगित फ्रा-2 एक कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली द्वारा दर्ज किया गया था । कुल SR सीए2 + रिलीज उत्प्रेरण के लिए कैफीन को रोजगार, हम उत्तेजना प्रणाली और छिड़काव प्रणाली को जोड़ने के द्वारा एक स्वत: छिड़काव स्विच कार्यक्रम पूर्व निर्धारित । फिर, मोनो घातीय वक्र फिटिंग कैल्शियम यात्रियों और कैफीन प्रेरित कैल्शियम दालों के क्षय समय स्थिरांक का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । तदनुसार, SR ca के योगदान2 +-ATPase (सेरका) और Na+-ca2 + एक्सचेंजर (NCX) डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने के लिए मूल्यांकन किया गया था ।
Introduction
Intracellular कैल्शियम ([सीए2 +]i) रीसाइक्लिंग cardiomyocytes1में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । जैसा कि हम जानते हैं, कैल्शियम प्रेरित Ca2 + रिहाई उत्तेजना संकुचन युग्मन, जो संकुचन के लिए बिजली के संकेत अनुवाद शुरू । झिल्ली ध्रुवीकरण sarcolemmal एल प्रकार सीए2 + चैनल, जो ryanodine रिसेप्टर्स 2 (RyR2) के माध्यम से कोशिका में एसआर से सीए2 + रिलीज प्रेरित सक्रिय करता है. क्षणिक ऊंचा cytoplasmic Ca2 + myofibrils के संकुचन शुरू होता है । diastole के दौरान, cytoplasmic ca2 + sr ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) के माध्यम से sr में reuptaken है और ना+-Ca2 + एक्सचेंजर (cardiomyocyte)2के माध्यम से NCX के बाहर पंप । इस प्रक्रिया में संकुचन की ओर जाता है-cardiomyocyte में छूट रीसाइक्लिंग ।
कार्डिएक एसआर सिकुड़ा मशीनरी के चारों ओर एक intracellular झिल्ली नेटवर्क है । यह संकुचन के लिए एक सीए2 + जलाशय के रूप में कार्य करता है, और यह विश्राम के दौरान intracellular ca2 + reअवशोषित । धड़कता के लिए उपलब्ध SR Ca2 + आरक्षित कार्डियक सिकुड़ना के लिए समाप्त हो गया है । इस बीच, intracellular Ca के हटाने2 + कार्डियक diastole के लिए महत्वपूर्ण है । मधुमेह और दिल की विफलता के रूप में कुछ pathophysiological स्थितियों, के तहत, बिगड़ा सीए2 + क्लीयरेंस और उदास SR ca2 + cardiomyocytes में स्टोर हृदय रोग की प्रक्रिया में शामिल किया जा सकता है2,3 ,4.
SR ca2 + रिलीज और डायस्टोलिक ca2 + हटाने cardiomyocytes में मापने के लिए, वहां दो व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण हैं: पैच के आधार पर NCX वर्तमान की अखंडता-क्लैंप5,6, और कैफीन प्रेरित सीए 2 + पल्स सीए2 + प्रतिदीप्ति इमेजिंग7,8,9पर आधारित है । पूर्व दृष्टिकोण तथ्य यह है कि Ca2 + SR से जारी काफी हद तक NCX द्वारा सेल के बाहर पंप है पर निर्भर करता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण उंनत उपकरण और निपुण आपरेशन की अपनी आवश्यकता के द्वारा सीमित है । वर्तमान अध्ययन में, हम एक सुविधाजनक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए SR ca2 + रिजर्व और ca2 + हटाने myocytes में एक कैफीन प्रेरित ca2 + पल्स एक ca2 + प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली पर आधारित को मापने के द्वारा मूल्यांकन । संक्षेप में, intracellular Ca2 + प्रतिदीप्ति फ्रा-2 द्वारा संकेत दिया है । उत्तेजना प्रणाली और छिड़काव प्रणाली को जोड़ने के द्वारा, हम स्वचालित रूप से छिड़काव और पेसिंग प्रणाली स्विचन के लिए एक कार्यक्रम प्रस्तुत करते हैं । 10 मिमी कैफीन तेजी से प्रेरित कुल सीए2 + सीनियर में जारी करने के लिए कार्यरत था कैल्शियम यात्रियों और कैफीन-प्रेरित कैल्शियम दालों की घातीय क्षय समय स्थिरांक (ताऊ) मोनो-घातीय वक्र फिटिंग, जो डायस्टोलिक Ca के लिए सेरका और NCX के योगदान को प्रतिबिंबित से प्राप्त किए गए2 + हटाने तदनुसार ।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों प्रयोगात्मक अनुसंधान केंद्र, चीन अकादमी चीनी चिकित्सा विज्ञान और झेजियांग विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किय?…
Representative Results
Discussion
कैल्शियम सीनियर से जारी फ्लक्स दिल में systole के लिए प्रमुख Ca2 + स्रोत है । कुछ हद तक, sr ca के आयाम2 + सामग्री और भिंन ca2 + sr से जारी की sr ca2 + हृदय संकुचन के लिए उपलब्ध आरक्षित प्रतिबिंबित । दूसरी ओर, सीन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८११००१५९, Dongwu लाइ; ८१४०११४७, Juhong झांग), झेजियांग प्रांत के चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान कार्यक्रम (सं. २०१६४६२४६, Dongwu लाइ), और स्वास्थ्य विज्ञान और हांग्जो सिटी (सं. 2013A28, डिंग लिन) की प्रौद्योगिकी योजना ।
Materials
| NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
| KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
| HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
| NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
| KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
| Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
| EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
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