फिजियोलॉजिकल रिलेशियल एसेस के प्रयोग से 3-डी स्टेम सेल कल्चर की पूछताछ के लिए हाईपीएससी डिरेक्ट सीरम फ्री एम्ब्रॉयड बॉडीज का विकास करना
Summary
यहां हम मानव प्रेरित-प्लुपीप्रोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से तीन आयामी (3-डी) प्रणाली विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जिन्हें सीरम मुक्त भ्रूण निकाय (एसएफईबी) कहा जाता है। यह 3-डी मॉडल का उपयोग मानवीय कॉर्टिकल विकास मॉडल के लिए एक अंगोपाटिक टुकड़ा संस्कृति की तरह किया जा सकता है और तंत्रिका सर्किट के विकास की शारीरिक पूछताछ के लिए किया जा सकता है।
Abstract
हालांकि इन्हें एचआईपीएससी के जरिये इन विट्रो बीमारियों के कई मॉडल विकसित किए गए हैं, एक सीमा यह है कि ये दो-आयामी (2-डी) प्रणालियां संक्रमित बीमारियों के प्रकार वाले संक्रमित व्यक्तियों की अंतर्निहित साइटोरेक्टिचचर और कार्यात्मक जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती हैं। परंपरागत 2-डी मॉडल विवो -जैसे संरचनाओं में अपूर्ण निरूपण रहते हैं और मस्तिष्क की जटिलता को पर्याप्त रूप से नहीं पकड़ते हैं। इस प्रकार, 3 डी एचपीएससी आधारित मॉडल के लिए एक उभरती हुई आवश्यकता है जो सेल्युलर इंटरैक्शन और कार्यों को एक विवो सिस्टम में देखा जा सकता है।
यहां हम सीरम मुक्त भ्रूण निकाय शरीर (एसएफईबी) के आधार पर अल्पसंख्यक HIPSCs से 3-डी प्रणाली विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह 3-डी मॉडल एक विक्रमित विक्रय किए गए नियोकार्टेक्स के पहलुओं को दर्पण करता है और अध्ययन, तंत्रिका कोशिकाओं और प्रवासन, कनेक्टिविटी, संचार और चटाई जैसे अक्षत ऊतक के अभिन्न अंगों में अध्ययन की अनुमति देता हैuration। विशेष रूप से, हम यह दिखाते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करते हुए एसएफईबी कैलीशियम इमेजिंग, और बहु-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) रिकॉर्डिंग के बिना क्रोसिंग के बिना शारीरिक-प्रासंगिक और उच्च-सामग्री वाले सेल आधारित एशेज का उपयोग कर पूछताछ कर सकते हैं। विदेश मंत्रालय के रिकॉर्डिंग के मामले में, हम यह दर्शाते हैं कि दीर्घकालिक खेती के दौरान एसएफईबी स्पाइक गतिविधि और नेटवर्क-स्तर की बड़बड़ाना गतिविधि दोनों में वृद्धि करते हैं। यह एसएफईबी प्रोटोकॉल 3-डी मॉडल में नेटवर्क निर्माण के विकास के अध्ययन के लिए एक मजबूत और स्केलेबल सिस्टम प्रदान करता है जो प्रारंभिक कॉर्टिकल विकास के पहलुओं को कैप्चर करता है।
Introduction
हमने पहले 3-डी मॉडल प्रणाली की सूचना दी है, जो मरीज से व्युत्पन्न मानव प्रेरित प्लूिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) से उत्पन्न होता है जो प्रारंभिक कॉर्टिकल नेटवर्क डेवलपमेंट 1 के कुछ पहलुओं का पुनर्कथन करता है। यह 3-डी मॉडल, एक सीरम मुक्त भ्रूण निकाय (एसएफईबी), पिछली सरल एकत्रीकरण हायपीएससी मॉडल 2 , 3 पर सुधार करता है। कार्य का एक बढ़ता हुआ शरीर यह खुलासा करता है कि हमारे एसएफईबी जैसे 3-डी ढांचे, तंत्रिकाय विकास के अनुमानित पहलुओं को सामान्यतः विवो में देखा जाता है और 2-डीमेंटल (2-डी) / मॉलालेयर हायपीएससी मॉडल 4 , 5 में देखे जाने से पहले के समय में। प्रारंभिक अध्ययन 3-डी निकायों की स्वयं-संगठित जटिलता को अपनी शारीरिक जटिलता 2 का प्रदर्शन किए बिना केंद्रित किया गया है।
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग फायब्रोबलास्ट्स से प्राप्त अल्पसंख्यक HIPSCs पर किया गया है और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) ये कोशिकाएं γ- विकिरणित माउस भ्रूणीय फीडर (एमईएफ) पर रखी जाती हैं। इन हायपीएससी कॉलोनियों को मैन्युअल रूप से अलग-अलग भेदभावित कोशिकाओं से साफ किया जाता है, एंजाइमेटिक काटा जाता है, और आरओ-किनास इनबीटर वाई -27632 (रोक्की) वाले मध्यम में रिसाव किया गया है। Undifferentiated hiPSCs 96-अच्छी तरह से कम आसंजन वी-नीचे प्लेटों में स्थानांतरित होने से पहले पृथक्करण और केन्द्रापसारक के अधीन हैं। चढ़ाना के बाद, न्यूरल प्रेरण दोहरी एसएएम 401542 और एलडीएन 1 9 58 9 को डिककॉप्फ़ 1 (डीकेके -1) के साथ शुरू किया जाता है ताकि एक अग्रस्थ अग्रगण्य न्यूरॉनल-भाग्य वंश 6 को चलाया जा सके। 14 दिनों के बाद, SFEBs को 6-अच्छी तरह से प्लेट में सेल संस्कृति आवेषण में स्थानांतरित किया जाता है। एक बार स्थानांतरित होने पर, दौर एसएफईबी फैल और पतली शुरू हो जाती है, जबकि स्थानीय नेटवर्क कनेक्शन को बनाए रखते हुए अक्सर हिप्पोकैम्पल इंडोटेपिक स्लाइस संस्कृति की तैयारी में समान सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करते हुए देखा जाता है 1 ,Ss = "xref"> 7
इस प्रारूप में एक एसएफईबी आधारित 3-डी प्लेटफॉर्म का उपयोग कॉर्टिकल नेटवर्क के कुशल उत्पादन के लिए सहज है, जिसे कैल्शियम इमेजिंग या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल एशेज जैसे एकल कोशिका रिकॉर्डिंग या मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) के आधार पर सेल आधारित शारीरिक assays का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है। 1 ) हालांकि 3 डी सिस्टम प्रारंभिक कोर्टिकल विकास के मार्करों को सहन करते हैं, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि इन 3-डी निकायों को मानव ऊतक विकास 8 की स्वाभाविक धीमी गति के लिए अधिक ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है। इस एसएफईबी प्रोटोकॉल ने आसानी से 3 डी एसएफईबी जनरेट किया है जो कि कोर्टेक्स के शुरुआती विकास के पहलुओं को प्राप्त करते हैं।
तंत्रिका संबंधी विकारों में मॉडल अपहरण के लिए एसएफईबी की क्षमता इस प्रणाली की ताकत है। रोगियों के ऊतकों से प्राप्त hiPSCs तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं में विकसित हो सकते हैं जो गधे के अधीन हैंसेल बायोलॉजी के साथ ही सहवर्ती जीन अभिव्यक्ति से संबंधित एआईएस आइटिज़्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (एएसडी), स्कीज़ोफ्रेनिया 9 , रिट सिंड्रोम 10 , और अल्जाइमर रोग 11 , 12 जैसी जटिल एटिओगॉल्स के साथ अलग-अलग स्नायविक विकार वाले व्यक्तियों के बड़े समूहों के आनुवंशिक प्रोफाइल का पता लगाने के लिए मानव आईपीएस एस का उपयोग किया जा रहा है। हाल ही में जब तक आईपीएससी मॉडल आम तौर पर मोनोलायर तैयारी थे, जबकि आणविक बातचीत का मूल्यांकन करने में निपुण, विवो में देखी गई जटिल सेलुलर इंटरैक्शन को समझने में अपर्याप्त थे। पूरे इंजन के मंच को पुनः बनाने के लिए पशु मॉडल डिफ़ॉल्ट विकल्प रहे हैं। इन जानवरों के मॉडल निष्कर्षों के खराब अनुवाद से ग्रस्त हैं और बड़े आनुवांशिक स्क्रीनिंग अध्ययनों द्वारा पहचाने जाने वाले मानव आनुवंशिक प्रोफाइल को दोहराने की सीमित क्षमता है। इस प्रकार, आईपीएससी से 3 डी सिस्टम का विकास मानव में जटिलता की एक आवश्यक परत जोड़ता हैबीमारी मॉडलिंग 13 , 14 3 डी हाईपसी प्लेटफार्मों के लिए अगले कदम सेल आधारित एलेक्स 15 का उपयोग करके उच्च थ्रूपूट स्क्रीनिंग के बड़े पैमाने पर आवश्यकताओं को समायोजित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक hiPSC स्रोत को 3 डी संरचना में अंतर करने की स्थिति प्रदान करता है जो ललाट कॉर्टेक्स के प्रारंभिक विकास चरण को पुनरावृत्त करता है। यह प्रक्रिया उन संरचनाओं की पैदावार करती है जिन्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आलेख प्रूफरीडिंग के लिए एलिजाबेथ बेनिविड्स का धन्यवाद करते हैं। हम डॉ। धन्यवाद उनके सहायक चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए जॉन हस्मन और जीन ब्लैट
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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