Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi
Summary
Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.
Abstract
HiPSC'leri kullanarak bir dizi in vitro hastalık modeli geliştirilmiş olsa da, bir sınırlama, bu iki boyutlu (2-B) sistemlerin, şüpheli hastalık varyantlarını taşıyan etkilenen bireylerin altında yatan sitolojik mimari ve fonksiyonel karmaşıklığı temsil etmeyebileceğidir. Konvansiyonel 2 boyutlu modeller in vivo benzeri yapıların eksik temsillerini tutar ve beynin karmaşıklığını yeterince yakalar. Dolayısıyla, in vivo bir sistemde görülen hücresel etkileşimleri ve işlevleri daha iyi özetleyebilen daha fazla 3-D hiPSC'ye dayalı modeller için yeni bir ihtiyaç ortaya çıkmaktadır.
Serbest embriyo gövdeye (SFEB) dayalı farklılaşmamış hiPSC'lerden 3 boyutlu bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 boyutlu model, gelişmekte olan bir ventralize neokorteksin özelliklerini yansıtır ve yaşayan sinir hücreleri ile göç, bağlantı, iletişim ve mat gibi bozulmamış dokular için ayrılmaz fonksiyonlara yönelik çalışmalara izin veriruration. Özellikle, protokolümüzü kullanan SFEB'lerin kalsiyum görüntüleme ve kriyoseksiyonsuz çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları gibi fizyolojik olarak alakalı ve içeriği yüksek hücre bazlı analizleri kullanarak sorguya çekilebileceğini gösteriyoruz. ÇÇ kayıtlarında, SFEB'lerin uzun süreli kültürde hem başak aktivitesini hem de şebeke seviyesinde patlama aktivitesini arttırdığını gösteriyoruz. Bu SFEB protokolü, erken kortikal gelişimin özelliklerini yakalayan 3 boyutlu bir modelde ağ oluşumunun geliştirilmesi çalışması için sağlam ve ölçeklenebilir bir sistem sağlar.
Introduction
Daha önce erken kortikal ağ 1 geliştirme bazı yönlerini tekrarlar hasta-türevi insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) oluşturulmuş bir 3-boyutlu bir model sistemi, bildirmişlerdir. Serumsuz bir embriyo gövdesi (SFEB) olan bu 3 boyutlu model, önceki basit toplama hiPSC modelleri 2 , 3'ü geliştirir . Işin artan vücut 5 / tek tabakalı hiPSC modelleri 4 eden SFEBs gibi 3-B yapısı, sinir gelişme yaklaşık yönleri genel olarak in vivo ve 2-boyutlu (2-D) 'de gözlenenden daha önceki bir zaman noktasında gözlemlenen açıklayıcıdır. İlk çalışmalar, fizyolojik karmaşıklığını göstermeksizin üç boyutlu cisimciklerin kendilerini organize eden karmaşıklığına odaklanmıştır 2 .
Burada açıklanan protokol, fibroblastlardan türeyen farklılaşmamış hiPSC'lerde ve Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler). Bu hücreler γ-ışınlanmış fare embriyonik besleyicilerinde (MEFler) muhafaza edilir. Bu hiPSC kolonileri kendiliğinden farklılaşmış hücrelerden manuel olarak temizlenir, enzimatik olarak hasat edilir ve Rho-Kinaz inhibitörü Y-27632 (ROCKi) içeren ortamda yeniden süspanse edilir. Farklılaşmamış hiPSC'ler 96 oyuk düşük yapışma V-alt plakalarına aktarılmadan önce ayrışma ve santrifüje tabi tutulur. Kaplama sonra sinir indüksiyon çift Smad inhibisyonu kullanılarak başlatılır (birlikte SB431542 ve LDN193189 dickkopf 1 (dkk-1)), bir ön-cephe ön beyin nöron kaderini soy 6 sürücü. 14 gün sonra, SFEB'ler 6 oyuklu bir plaka içerisinde hücre kültür eklerine aktarılır. Bir kez aktarıldıktan sonra yuvarlak SFEB'ler yayılmaya ve inceltmeye başlarken, benzer hücre kültürü ekleri kullanan hipokampal organotipik dilim kültürü preparatlarında sıklıkla gözlendiği gibi yerel ağ bağlantılarını muhafaza ederek 1 ,Ss = "xref"> 7.
Bu formatta bir SFEB tabanlı 3 boyutlu platformun kullanımı kalsiyum görüntüleme veya tek hücreli kayıtlar veya çok elektrotlu dizi (MEA) gibi elektrofizyolojik testler gibi hücre bazlı fizyolojik tahliller kullanılarak sorgulanabilecek kortikal şebekelerin etkili bir şekilde üretilmesine uygundur ) 1 . 3 boyutlu sistemler erken kortikal gelişim işaretleri ayı rağmen, diğer çalışmalar bu 3 boyutlu cisimler insan dokusu gelişimi 8'in doğal olarak daha yavaş bir hızda izin vermek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir göstermiştir. Bu SFEB protokolü, kortekste erken gelişim özelliklerini yakalayan farklılaşmamış hiPSC'lerden başarıyla 3-D SFEB'ler üretir.
SFEB'lerin nörolojik bozukluklarda ağ aberasyonlarını modelleme potansiyeli bu sistemin gücüdür. Hasta dokusundan türetilen hiPSC'ler, sinir sisteminin kıçına tabi olan hücrelere yetiştirilebilirHücre biyolojisine ve aynı zamanda gen ekspresyonuna ilişkindir. İnsan iPSC'leri, otizm spektrum bozukluğu (ASD), şizofreni 9 , Rett Sendromu 10 ve Alzheimer hastalığı 11 , 12 gibi karmaşık etyolojilere sahip çeşitli nörolojik bozukluklara sahip geniş birey gruplarının genetik profilini tespit etmek için kullanılmaktadır. Yakın zamana kadar, iPSC modelleri tipik olarak, moleküler etkileşimleri değerlendirmede yeterli iken , in vivo görülen karmaşık hücresel etkileşimleri deşifrelemede yetersiz kalan tek tabaka preparatlarıydı. Hayvan modelleri, tümör organı platformunun yeniden oluşturulması için varsayılan ikame olmuştur. Bu hayvan modelleri, bulguların zayıf bir şekilde çevrilmesinden dolayı rahatsızdır ve büyük genetik tarama çalışmaları ile tanımlanan insan genetik profillerini çoğaltma yeteneği sınırlıdır. Böylece, iPSC'lerden 3-B sistemlerin geliştirilmesi, insan için gerekli bir katman katma- sını katarHastalık modelleme 13 , 14 . 3D hiPSC platformları için bir sonraki adım, hücre bazlı tahliller kullanılarak yüksek verimli taramada büyük ölçekli gereksinimleri karşılamaktır 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, bir hiPSC kaynağının frontal korteksin erken gelişim evresini yineleyen 3 boyutlu bir yapıya ayırma koşullarını sağlar. Bu prosedür, aynı zamanda mikroskopi yapılmaya elverişli olan elektrofizyoloji için sorgulanabilen yapılar üretir. SFEB'nin son morfolojisi, organotipik beyin dilim kültürlerine benzemekte ve yüksek kaliteli ayrıntılı konfokal görüntülemeye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, hem fibroblast hem de periferik-kan mononükleer hücre kaynaklı hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makaleyi düzeltmek için Elizabeth Benevides'e teşekkür ediyoruz. Dr Dr teşekkür ederim. John Hussman ve Gene Blatt'ın yararlı tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
