양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로
Summary
이 원고는 상향 및 하향 벡터 – 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.
Abstract
통합 사이트 (IS) 분석은 레트로 바이러스 통합 사이트 및 그 생물학적 중요성에 대한 연구에서 중요한 요소입니다. 최근의 레트로 바이러스 유전자 치료 연구에서, IS 분석은 차세대 시퀀싱과 함께 동일한 IS를 공유하는 줄기 세포 집단을 특성화하기위한 세포 추적 도구로 사용되었습니다. 서로 다른 샘플 내에서 그리고 다른 샘플 간에서 재 축적 된 줄기 세포 클론을 정확하게 비교하기 위해 분석의 검출 감도, 데이터 재현성 및 처리량이 가장 중요한 분석 품질 중 하나입니다. 이 작업은 양방향 IS 분석을위한 상세한 프로토콜 및 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다. 양방향 분석은 상류 및 하류 벡터 – 숙주 접합을 동시에 서열화할 수있다. 기존의 단방향 IS 시퀀싱 접근 방식과 비교할 때 양방향 접근 방식은 IS 탐지 속도와 t 양 끝에서 통합 이벤트의 특성을 크게 향상시킵니다.DNA를 목표로합니다. 여기에 설명 된 데이터 분석 파이프 라인은 IS 시퀀스를 참조 게놈에 매핑하고 시퀀싱 오류를 결정하는 여러 단계의 비교를 통해 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 열거합니다. 최적화 된 분석법을 사용하여 히말라포마 원숭이에 이식 한 후 수천 개의 조혈 줄기 세포 (HSC) 클론의 상세한 모집단 패턴을 최근에 발표하여 HSC 재조합의 정확한 시점과 HSC의 기능적 이질성을 처음으로 입증했습니다. 영장류 시스템. 다음 프로토콜은 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 정량화하는 단계별 실험 절차 및 데이터 분석 워크 플로를 설명합니다.
Introduction
레트로 바이러스는 게놈 DNA를 다양한 위치의 숙주 게놈에 삽입합니다. 암과 다른 형태의 바이러스 발병 기전의 발달에 기여할 수있는이 고유 한 특성은 유전자 치료 및 기초 생물학 연구를 위해이 바이러스를 세포 공학에 매우 적합하게 만드는 아이러니 한 이점이 있습니다. 외래 DNA (바이러스)가 통합 된 숙주 게놈의 위치 인 바이러스 통합 사이트 (IS)는 통합 바이러스와 숙주 세포의 운명에 중요한 영향을 미칩니다. IS 분석은 다양한 생물학적 및 임상 연구 환경에서 레트로 바이러스 통합 사이트 선택 및 병인, 암 발달, 줄기 세포 생물학 및 발달 생물학 1 , 2 , 3 , 4 를 연구하는 데 사용되었습니다. 낮은 검출 감도, 낮은 데이터 재현성 및 빈번한 교차 오염현재 및 계획된 연구에 IS 분석법의 적용을 제한하는 핵심 요인.
많은 IS 분석 기술이 개발되었습니다. 링커 매개 (LM) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 5 , 역 PCR 6 및 선형 증폭 (Linear-Amplification-Mediated) PCR 7을 포함한 제한 효소 기반 통합 사이트 분석이 가장 널리 사용됩니다. 그러나 현장 특이적인 제한 효소의 사용은 IS 검색 중에 편향을 일으키고, 제한 효소 근처에서 통합 될 하위 집합 (숙주 게놈에 통합 된 외래 DNA) 만 회수 할 수 있습니다 4 . 최근에 벡터 IS를보다 종합적으로 평가하는 분석 기술이 도입되었습니다. 이러한 분석법은 Mu transposon-mediated PCR 8 , 비 제한적 (nr) -LAM PCR 9 , type-II 제한 효소 -mediated digestion 10 , mechanical shearing 11 , random hexamer-based PCR (Re-free PCR) 12 를 사용하여 게놈 DNA를 단편화하고 IS를 증폭합니다. 현재의 기술은 다양한 수준의 검출 감도, 게놈 범위, 표적 특이성, 높은 처리량, 분석 절차의 복잡성 및 표적 부위의 상대적 빈도를 검출하는 편향을 가지고 있습니다. 기존의 분석법의 다양한 특성과 이들이 사용될 수있는 다양한 목적을 고려할 때 최적의 분석법을 신중하게 선택해야합니다.
이 작업은 통합 표적 DNA의 IS 업스트림 및 다운 스트림을 동시에 분석함으로써 검출 속도 및 서열 정량 정확도를 크게 향상시키는 양방향 분석을위한 자세한 실험 절차 및 컴퓨터 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다 (그림 1의 분석 절차 개요도 참조). ). 이 방법은 또한레트로 바이러스 통합 과정을 특성화하는 수단 (예 : 표적 부위 복제의 정확도 및 상류 및 하류 삽입의 게놈 서열 변화). 다른 양방향 방법은 표적 DNA 11 , 13 , 14 의 양 끝을 복제하고 시퀀싱하기 위해 주로 사용되었습니다. 이 분석법은 잘 확립 된 LM-PCR 방법 및 전산 해석 매핑을 사용하고 상류 및 하류 접합을 정량화하기 위해 벡터 표시 클론의 고효율 및 재현성 정량을 위해 광범위하게 최적화되어 있습니다. TaqαI 효소의 양방향 분석은 줄기 세포 유전자 치료 전임상 연구에서 높은 처리량 클론 정량화에 유용함이 입증되었다. 이 논문은 t를 두 배로하는 더 빈번한 커터 (RsaI / CviQI – motif : GTAC)를 사용하는 수정 된 방법을 기술한다그는 TaqαI에 기반한 분석에 비해 integromes를 검출 할 가능성이 있다. 렌티 바이러스 (NL4.3 및 그 유도체) 및 감마 – 레트로 바이러스 (pMX 벡터) 벡터 IS 분석을위한 GTAC 모티프 효소를 사용하는 상세한 실험 및 데이터 분석 절차가 기술되어있다. 분석에 사용 된 올리고 뉴클레오타이드는 표 1 에 열거되어있다. 보충 문서에는 IS 서열 분석을위한 사내 프로그래밍 스크립트가 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
양방향 분석은 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 벡터 – 숙주 DNA 결합 서열 모두의 동시 분석을 가능하게하며 다수의 유전자 치료, 줄기 세포 및 암 연구 응용에 유용하다. GTAC- 모티프 효소 (RsaI 및 CviQI) 및 양방향 PCR 접근법을 사용하면 이전의 TCGA- 모티프 ( TaqαI ) 효소 ( 2 , 15 및 기타)와 비교할 때 인테그랄 (또는 클론 개체군)을 검출 할 가능성이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기금은 국립 보건원 R00-HL116234, U19 AI117941 및 R56 HL126544에 의해 제공되었다. 국립 과학 재단 보조금 DMS-1516675; 한국 연구 재단 (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); KRIBB 이니셔티브 프로그램.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
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